油茶组培苗高效增殖体系的建立

王 瑞 ，陈永忠 ，王湘南 ，彭邵锋 ，陈隆升 ，马 力 ，罗 健 ，杨小胡

（1. 中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；3. 国家油茶工程技术研究中心，湖南 长沙 410004)

油茶组培苗高效增殖体系的建立

王 瑞1，2，3，陈永忠2，3，王湘南2，3，彭邵锋2，3，陈隆升2，3，马 力2，3，罗 健2，3，杨小胡2，3

（1. 中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004；3. 国家油茶工程技术研究中心，湖南 长沙 410004)

以油茶优良无性系“湘林1号”的茎段为外植体培养的无菌苗为材料，开展了无菌苗增殖培养研究，研究结果表明：基本培养基及外源激素均对油茶无菌苗增殖培养产生重要作用，以WPM为基本培养基，激素组合为6-BA5.0 mg/L+NAA0.01 mg/L+生物素1.0 mg/L时，增殖系数达最高值3.90；以MS为基本培养基，激素组合为6-BA1.0 mg/L+NAA0.01 mg/L +生物素0.5 mg/L 时，新梢生长量达2.01 cm。

油茶；优良无性系；组织培养；增殖体系

油茶Camellia oleifera是我国特有的木本食用油料树种，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料树种，湖南、江西、广西等省区是其主要集中产区。油茶的主要产品茶油不饱和脂肪酸高达90%左右，富含脂溶性VA、VE、VK，可预防心血管硬化，降血压，降血脂等，是一种理想的营养保健食用油[1]。此外，茶油还被广泛地应用于工业、医药、化妆业领域中，具有很高的经济价值。

我国的油茶种植历史悠久，在选择育种、良种繁育、丰产栽培、加工利用等方面积累了丰富的经验和取得重大进展，但在油茶组织培养方面的研究起步较晚，从20世纪80年代开始有学者对油茶组织培养进行研究，但进展缓慢，一直未获得生根较好的苗木[2-6]。而组织培养对油茶优良种质资源和性状的保存、生物技术育种有着深远而重大的意义，对油茶产业的发展也将产生重要影响。笔者以“湘林”系列油茶优良无性系为材料，开展了油茶组培苗丛生芽增殖体系的研究，为油茶植株再生体系的建设奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料来自湖南省林业科学院国家级油茶种质资源收集保存库（国家林业局油茶研究开发中心试验基地），为油茶优良无性系“湘林1号”优树。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体采集

于2008年4月，采集长10～25 cm的油茶枝条带回实验室，将茎段剪切成带1～2个腋芽、长约1.5～2.0 cm的小段，用流水冲洗干净后用中性洗衣粉水轻洗枝条，置于流水下冲洗2～3 h。

1.2.2 无菌苗的获得

将冲洗后的外植体置无菌超净台上，先用75%酒精快速灭菌10 s，然后用无菌水冲洗3次，接着用0.1%HgCl2消毒2 min，用无菌水冲洗3次，再用0.1%HgCl2消毒3 min，最后用无菌水冲洗5次后接种于诱导培养基WPM+6-BA1.0 mg/L+IBA0.5 mg/L+蔗糖20 mg/L+琼脂7 mg/L上培养后获得无菌苗。

1.2.3 试验设计

试验采用正交设计L9（34），选用了3种不同的基本培养基MS、WPM、B5，附加不同浓度的6-苄氨基腺呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、生物素，正交设计详见表1。

表1 正交试验表Table 1 Orthogonal experiment table

1.2.4 培养条件

培养基中蔗糖3.0%，琼脂7 g/L。培养基用1 mol/L NaOH或HCl调节pH值为5.8～6.2，在恒温120℃和恒压1.1个大气压下消毒灭菌20 min。培养室温度（25±3）℃，光照时间12 h·d-1，光照强度2 000 lx。

1.2.5 数据统计

所有处理都进行3次重复，采用SAS9.0对数据进行单因素方差分析及多重比较。

2 结果与分析

2.1 基本培养基、外源激素种类及浓度对苗木增殖系数的影响

方差分析结果可以看出，总效应、基本培养基类型和生物素浓度的效应均达到0.01显著水平，6-BA浓度的效应达到0.05显著水平，NAA浓度的效应没有达到显著水平，说明基本培养基类型和生物素的浓度对油茶组培苗增殖系数的影响极大，6-BA的浓度对油茶组培苗增殖系数的有一定的影响，而NAA则影响不大。

表2 不同处理对增殖系数影响方差分析表Table 2 Variance analysis table of influence of different treatment on multiplication coefficient

表3 各因素对增殖系数影响方差分析表Table 3 Variance analysis table of influence of different factors on multiplication coefficient

表4 基本培养基、外源激素对增殖系数的影响†Table 4 Influence of basic medium and hormone on multiplication coefficient

基本培养基：从表4可以看出，3种不同的基本培养基（MS培养基、WPM培养基、B5培养基）对油茶组培苗增殖的影响存在极显著差异（p＜0.01），多重比较表明，WPM培养基与MS培养基、B5培养基分别存在显著差异，而MS培养基、B5培养基之间不存在显著差异，其中以 WPM培养基的增殖效果最好，三种不同培养基的平均增殖系数为：WPM培养基（2.94）＞MS培养基（1.53）＞ B5培养基（1.42）。

细胞分裂素（6-BA）：细胞分裂素在组织培养继代过程中起关键作用，细胞分裂素浓度的高低直接影响增值系数，试验选用细胞分裂素（6-BA），设计了3种不同的的浓度（1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L），结果表明不同的6-BA浓度对油茶组培苗增殖的影响存在显著差异。多重比较表明，1.0 mg/L与3.0 mg/L、5.0 mg/L间分别存在显著差异，而3.0 mg/L、5.0 mg/L间不存在显著差异，说明细胞分裂素6-BA的浓度对油茶组培苗增殖系数的影响显著，并且随6-BA浓度的升高，增殖系数增大，所以较高浓度的细胞分裂素有利于提高油茶继代苗的增殖系数，本试验中，细胞分裂素（6-BA）的浓度以5.0 mg/L为最佳。

生长素（NAA）：试验设计了3种不同的生长素（NAA）的浓度（0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L），从方差分析结果可以看出，3种不同的浓度间均不存在显著差异，说明生长素NAA的浓度对增殖系数没有显著影响。

生物素：对不同的生物素浓度对增殖系数的影响效果进行显著性分析表明：不同浓度的生物素对油茶组培苗增殖的影响存在极显著差异，1.0 mg/L与0.5 mg/L、1.5 mg/L间分别存在显著差异，而0.5 mg/L、1.5 mg/L间不存在显著差异，本试验中，以生物素浓度为1 mg/L效果最好，浓度过高或过低都不能促进其增殖系数的增加，增殖系数反而受抑制。

综合单因素分析结果，在油茶增殖培养阶段，以WPM培养基、6-BA 5.0 mg/L、生物素1.0 mg/L为最佳，即6号处理，增殖系数高达3.90。

图1 油茶芽苗在6号处理上的生长情况Fig.1 The growth of tissue culture seedlings on treatment 6

2.2 基本培养基及植物激素对苗木生长量的影响

油茶组培苗的高度和质量是决定组培苗是否生根的关键因素，而组培苗的生长速度（以相同时间内组培苗的净生长量来衡量，本文中称“苗高”）又决定了培养周期的长短，研究了基本培养基、外源激素种类及浓度对苗高的影响。

表5 不同处理对苗高影响方差分析表Table 5 Variance analysis table of influence of different treatment on seedling height

表6 各因素对苗高影响方差分析表Table 6 Variance analysis table of influence of different factors on seedling height

方差分析结果表明，基本培养基、激素类型及激素浓度对油茶继代苗苗高的影响均达到了极显著水平，说明基本培养基、激素类型及激素浓度对油茶组培苗苗高影响很大。

基本培养基：对不同基本培养基对苗高影响效果进行显著性分析表明：3种不同培养基间均存在极显著差异，说明基本培养基对继代培养过程中的油茶组培苗苗高影响显著，以MS培养基效果最好。

细胞分裂素（6-BA）：由表7可以看出，不同的6-BA浓度对油茶组培苗苗高的影响存在极显著差异，5.0 mg/L与1.0 mg/L、3.0 mg/L间分别存在显著差异，而1.0 mg/L、3.0 mg/L间不存在显著差异（见表7），说明不同浓度的6-BA对苗高的影响差异显著，以浓度为1.0 mg/L效果最好，浓度的提高，并不能促进其苗高的增加。

生长素（NAA）：生长素的主要生理作用是促进细胞伸长，若选择的激素种类及浓度合适，可以有效的促进植株生长，本实验中选用最常用的萘乙酸（NAA），从方差分析结果可以看出，3种不同浓度的生长素NAA对组培苗苗高的影响均存在极显著差异，说明不同浓度的NAA对苗高的影响差异显著，以浓度为0.01 mg/L效果最好，浓度的提高，并不能促进其高度的增加，当浓度达到0.1 mg/L时反而受抑制。

表7 基本培养基、外源激素对苗高的影响†Table 7 Influence of basic medium and hormone on seedling height

生物素：经方差检验结果表明：不同的生物素浓度对油茶组培苗苗高的影响存在极显著差异，1.5 mg/L与0.5 mg/L、1.0 mg/L间分别存在极显著差异，而0.5 mg/L、1.0 mg/L间不存在显著差异，说明生物素浓度对油茶组培苗苗高影响显著，以生物素浓度为0.5 mg/L效果最好，浓度的提高，并不能促进其苗高的增加，当浓度达到1.5 mg/L时反而受抑制。

综合单因素分析结果，以MS培养基、6-BA 1.0 mg/L、NAA0.01 mg/L、生物素0.5 mg/L为最佳，即1号处理，苗木净生长量为2.01 cm。

图2 油茶芽苗在1号处理上的生长情况Fig.2 The growth of tissue culture seedlings on treatment No.1

3 结论与讨论

（1）基本培养基对油茶组织培养影响很大。研究结果表明，基本培养基对油茶组织培养影响较大，不同的基本培养基适合于油茶组织培养的不同阶段，WPM培养基有利于苗木的增殖，MS培养基有利于组培苗新梢的生长，这与谭文澄等提到的“山茶属对培养基的要求不太严格”不一致[7]。

（2）外源激素对增殖系数的影响。细胞分裂素和生长素分别控制细胞质和细胞核的分裂，从而影响组培苗的增殖，细胞分裂素和生长素均为重要因子，但研究过程中发现，细胞分裂素的浓度对增殖系数的影响存在极显著差异，并且细胞分裂素浓度越高，增殖系数越大，而生长素的浓度对增殖系数的影响无显著差异，说明在油茶组培苗增殖过程中，细胞分裂素的作用大于生长素。这是因为，一方面，细胞分裂素促进了内源生长素的合成，从而对外源生长素的需求量减少；另一方面，幼嫩的组织自身能够合成部分生长素，这也许是造成外源细胞分裂素相对重要的原因。研究结果表明，激素组合以6-BA 5.0 mg/L+NAA0.01 mg/L +生物素1.0 mg/L为最佳组合，增殖系数高达3.90。

（3）外源激素对苗高的影响。研究过程中发现，细胞分裂素及生长素的浓度对苗高的影响均存在极显著差异，并且浓度越低，新梢生长量越大，说明细胞分裂素和生长素均发挥重要作用，只有两者交互作用，才能促进新梢的生长。研究结果表明，激素组合以6-BA 1.0 mg/L+NAA0.01 mg/L+生物素0.5 mg/L为最佳组合，苗木净生长量达2.01 cm。

[1]陈永忠,王德斌.湖南省油茶良种选育及推广应用概况[J].湖南林业科技,2001,28(3)：23-27.

[2]陈永忠,杨小胡,彭邵锋,等.我国油茶良种选育研究现状及发展策略[J].林业科技开发,2005,19(4)：1-4.

[3]毕方铖,谭晓风,张智俊,等.油茶离体培养诱导再生植株的研究[J].经济林研究,2004,22(2)：5-9.

[4]丁植磊,张日清,刘友全,等.油茶12个物种花药愈伤组织诱导及继代培养[J].经济林研究,2007,25(1)：20-24.

[5]张智俊,罗淑萍,李亚玲,等.油茶优良无性系子叶体细胞胚植株再生[J].植物学通报,2005,22(增刊)：43-49.

[6]李建安,张日清,石明旺,等.油茶两物种花药培养愈伤组织诱导试验[J].经济林研究,2003,21(3)：36-38.

[7]谭文澄,戴策刚. 观赏植物组织培养技术[M].北京：中国林业出版社,1998.

Establishment of High Efficient Propagation System of Tissue Culture Seedling of Camellia oleifera

WANG Rui1,2,3, CHEN Yong-zhong2,3, WANG Xiang-nan2,3, PENG Shao-feng2,3, CHRN Long-sheng2,3, MA Li2,3, LUO Jian2,3, YANG Xiao-hu2,3
(1. Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China; 3. National Oil-tea Camellia Engineering & Technology Research Center, Changsha 410004, Hunan, China)

Sterile seedlings ofCamellia oleiferasuperior clones “XL1”, which induced from stem segments,were taking as materials,and proliferation culture were studied. The results showed that： basic medium and exogenous hormones played important roles in proliferation culture, the shoots were subcultured and multiplied on WPM medium containing 5.0 mg/L 6-BA, 0.01 mg/L NAA and 1.0 mg/L biotin, and proliferation coefficient reached 3.90; the young sprout of seedlings grew rapidly on MS medium containing 1.0 mg/L 6-BA, 0.01 mg/L NAA and 0.5mg/L biotin,which reached 2.01 cm.

Camellia oleifera;superior clones;tissue culture; proliferation

S727.3；S794.4

A

1673-923X(2015)10-0040-04

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.10.007

2014-02-10

湖南省科技重大专项“油茶良种繁育与生态高效培育关键技术研究与示范”（2013FJ1006）

王 瑞，博士研究生，助理研究员

陈永忠，博士，研究员；E-mail：chenyongzhong06@163.com

王 瑞，陈永忠，王湘南，等. 油茶组培苗高效增殖体系的建立[J].中南林业科技大学学报，2015, 35(10)： 40-43.

[本文编校：吴 彬]