Caspase—3和神经生长因子在高胆红素血症脑损伤中的研究

刘榕 阴怀清

[摘要] 高胆红素血症可导致神经细胞的坏死或凋亡，最终引起不同程度的脑损伤。目前对凋亡的研究过程中，人们发现Caspase-3在诱导细胞凋亡的分子机制中有重要作用。神经生长因子是第一个被发现的神经营养因子，众多研究表明：颅脑损伤后神经生长因子可保护受损的神经元，促进轴突定向再生，增加乙酰胆碱表达，改善胆碱能神经元功能，提高脑灌注，从而改善脑功能。本文主要对Caspase-3与神经生长因子在高胆红素血症脑损伤中的影响进行综述。

[关键词] 高胆红素血症；细胞凋亡；Caspase；神经生长因子

[中图分类号] R722.17 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）31-0157-04

Study on Caspase-3 and nerve growth factor in brain injury in hyperbilirubinemia

LIU Rong1 YIN Huaiqing2

1.Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China； 2.Department of Pediatrics，the Affiliated First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001， China

[Abstract] Hyperbilirubinemia can lead to neuronal cell necrosis or apoptosis，resulting in varying degrees of brain damage.At present，in the process of study on apoptosis，people found that Caspase-3 plays a key role in the molecular mechanism of inducing cell apoptosis.Nerve growth factor is the first discovered neurotrophic factor，numerous studies show that：after brain injury，nerve growth factor can protect damaged neurons，promote axon directed regeneration，increase the expression of acetylcholine，improve the function of cholinergic neurons and improve brain perfusion，thereby improving brain function.This article mainly reviewed the influence of Caspase-3 and nerve growth factor on brain injury in hyperbilirubinemia.

[Key words] Hyperbilirubinemia； Apoptosis； Caspase； Nerve growth factor

新生儿高胆红素血症是新生儿期最常见的问题，也是新生儿住院的主要原因之一，近年来发病率逐步上升，现高达30%～50%[1]。如治疗不当可引发胆红素脑病，即核黄疸（kernicterus），导致不同程度的脑损伤，轻则会导致远期智商、情商低下、听力损伤等，重则会造成新生儿死亡。有报道称，约2/3存活患儿可遗留永久的神经系统后遗症[2]，对新生儿的健康造成极大威胁。因此，深入研究高胆红素血症脑损伤的发病机制及防治措施，对其发病率的控制有重要意义。本文就Caspase-3与神经生长因子的结构、功能及其在高胆红素血症脑损伤中的作用进行综述，有助于高胆红素血症脑损伤的研究。

1 Caspase-3与高胆红素血症脑损伤

1.1 Caspase

Caspase是在对哺乳动物细胞的凋亡进行研究时，人们发现的一组ICE（interleukin-1β convert enzyme，即Caspase-1）类蛋白，是一组半胱氨酸蛋白酶[3]，在细胞凋亡过程中有着关键作用，有以下共同点：①与Caspase-1有同源性；②其氨基端的一段序列被水解后可激活以无活性的酶原形式存在的底物；③底物中存在的天冬氨酸羧基端肽键在催化时断裂[4]；④有高度保守五肽序列[5]；⑤Caspase被水解后可产生级联放大效应；⑥Caspase家族一般有抑制剂[6，7]。目前至少16种Caspase在哺乳动物中被发现，根据其被发现的先后顺序命名为Caspase-1～Caspase-16[6]。

1.2 Caspase-3与细胞凋亡

迄今为止，研究比较透彻的是作为主要的效应者分子的Caspass-3。人Capsape-3基因定位于染色体4q33-q35处。目前众多研究表明，在哺乳动物细胞凋亡中Caspase-3是关键蛋白酶，且Caspase-3活化后可通过3种途径导致细胞解体[8]：①裂解胞内的骨架蛋白和胞外的细胞外基质，如肌动蛋白、角质蛋白等。②裂解凋亡抑制物，如核酸内切酶抑制剂（ICAD/DFF45）、Bcl-2等。③DNA修复相关分子的裂解，如DNA依赖性蛋白激酶。

底物被酶解失活后会导致细胞的形态、功能发生一系列变化，表现为细胞皱缩，胞质致密，核染色质边集，而后胞核裂解，胞质生出芽突并脱落，形成核碎片和（或）细胞器成分的膜包被小体，即凋亡小体。凋亡现象在本质上是一系列Caspase的级联切割过程。

1.3 高胆红素血症脑损伤机制

胆红素可引起神经细胞凋亡增加，已在体内外实验中得到肯定，但引起凋亡的具体发病机制仍不清楚，其可能机制如下：

1.3.1 Ca2+超载 各种原因引起的细胞内钙含量异常增多并导致细胞结构损伤和功能代谢障碍的现象称为钙超载。众多研究表明[9，10]，胞质中Ca2+浓度的升高与细胞凋亡（apoptosis，AP）之间存在着密切的联系。胆红素进入脑组织后可能通过影响细胞膜对钙离子的通透性，影响膜上钙泵的活性等使细胞内形成钙超载现象，从而导致细胞凋亡。

1.3.2 影响线粒体呼吸功能 线粒体中有许多非常重要的蛋白酶或蛋白质，它们与细胞凋亡直接相关，如凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）、细胞色素C[11]、Bcl-2家族成员、半胱氨酸水解酶[12]等，它是真核细胞的动力加工厂，在介导细胞凋亡的信号转导过程中起着重要作用。Schif等通过实验发现细胞中胆红素发挥其毒性作用的最初部位是线粒体。50年代，Zeterstron和Ernster发现，能达到抑制小鼠肝、脑细胞线粒体的磷酸化及生物氧化作用的胆红素浓度是300M。Rodrigues等[13]通过实验证实解离线粒体氧化磷酸化是胆红素的主要毒性作用，胆红素可改变线粒体膜的通透性，导致细胞色素C释放，再作用于一些激酶和水解酶，启动神经细胞凋亡。

因此，胆红素通过造成胞内Ca2+超载，影响线粒体的呼吸功能从而造成神经细胞的凋亡[14]。动物实验结果显示：高胆红素血症可诱导模型鼠脑组织Caspase-3表达增加，Caspase-3的表达在造模后24 h后出现高峰，表明过多的Caspase-3参与了高胆红素血症脑损伤的发生[15]，但在此分子链中具体的信号传导机制及过程尚未完全阐明。

2 神经生长因子及其对中枢神经损伤的保护作用

2.1神经生长因子简介

神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是第一个被发现的神经营养因子，目前为人们所熟悉的经典的NGF是从小鼠颌下腺分离所得，其相对分子质量为140×103，是一种蛋白质，由118个氨基酸组成，由以非共价键结合的一个β亚单位、两个α亚单位及两个γ亚单位组成，其分子组成中含有2个锌原子，增加了分子的稳定性，其中有活性的亚基是β亚单位[16，17]。目前，人类NGF的基因序列已经明确，研究表明：人类NGF与小鼠NGF有90%的同源性[18]。NGF通过与其受体的结合发挥作用，哺乳动物中存在两种可与NGF结合的跨膜受体，即高亲和力受体酪氨酸激酶受体（TrkA）和低亲和力受体p75NTR。当TrkA和p75NTR共同存在时，p75NTR可通过增加TrkA与NGF的亲和力促进神经细胞轴突的生长，但当p75NTR单独存在时，则会介导细胞的凋亡[19]。

2.2 NGF对中枢神经损伤的保护作用

颅脑损伤后，应用外源性NGF可促进神经纤维再生，诱导轴突定向生长，修复受损的神经元。黄莉等[20]通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑病模型，应用外源性NGF对其进行干预，证实新生大鼠缺氧缺血后，NGF可使其皮质和海马部位的神经细胞凋亡明显减轻，脑组织病理及超微结构改变均减轻。龙琦等[21]用神经生长因子（NGF）、外源性碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及二者联合用药分别对缺氧缺血脑损伤（HIBD）新生大鼠进行干预后发现，NGF、bFGF均可提高HIBD后海马区神经元的数量；而二者联合应用则可明显提高神经元的数量。孔祥梅等[22]的进一步研究中，先用谷氨酸造成体外培养的大脑基底神经节神经元损伤，再用NGF干预，发现NGF保护组大脑基底神经节GAP-43mRNA和NF-L表达较对照组高，差异有统计学意义。GAP-43在神经系统正常活动所必需的轴浆运输中有重要作用，而轴浆运输与神经再生及损伤后修复有密切关系，表明NGF可促进神经元再生。同时，Ziemba等[23]的研究移植神经定向生长的实验中，将载有神经生长因子基因序列的病毒载体植入特定区域，发现随着NGF的表达，植入大鼠胼胝体处的背根神经元有向高浓度NGF区域生长的趋势。Jin Y等[24]也证实在颅脑损伤时，通过复合介导途径，NGF可使轴突通过损伤区生长。以上研究证实了NGF的神经元保护作用，其具体机制可能如下：

2.2.1 拮抗自由基作用 神经细胞内含有许多自由基清除剂，如过氧化物歧化酶、过氧化氢酶等，颅脑损伤致白细胞活化后会释放一些对细胞有害的细胞因子，如IL-6和氧自由基等，而这些有害的细胞因子反过来又会加重脑损伤。周政等[25]用NGF对大鼠转基因后研究发现，与对照组相比，NGF转基因大鼠发生短暂脑缺血损伤后，其脑皮质、海马区中神经细胞的凋亡明显减少，而一些自由基清除剂如铜锌超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶等的含量明显增高。也有实验证明[26]：NGF可通过增加自由基清除剂的活性，减轻颅脑损伤时神经元的凋亡。

2.2.2 细胞内ca2+水平的稳定 脑缺血脑损伤后，通过促进氧自由基生成、加重酸中毒、破坏细胞膜等途径可使细胞内形成Ca2+超载现象，从而引起神经元的坏死或凋亡。有研究表明[27]：离体细胞在外源性H2O2存在时，胞内Ca2+会明显增加，而（1～100）μg/L的NGF可抑制低浓度H2O2（0.05 mmol/L）引起的Ca2+升高，且呈剂量依赖性，提示NGF通过稳定细胞内Ca2+的水平来保护损伤神经元。Cheng等[28]认为其原因可能是NGF增强细胞排出及缓冲Ca2+的能力，提示NGF能通过影响那些调节Ca2+内流的蛋白质（如谷氨酸受体、电压依赖Ca2+通道、Na+和K+通道等）的表达及功能，发挥其对神经元的保护作用。

2.2.3 拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性 兴奋性氨基酸中与缺血性脑损伤有关的主要是谷氨酸，正常情况下参与中枢神经系统的信息传递，但过量的谷氨酸会损伤神经元。当谷氨酸浓度升高时，通过NMDA信号传导途径使细胞内形成Ca2+超载现象，进而导致细胞凋亡[29]。王艳辉等[30]的实验证明：与兴奋性氨基酸毒性作用有关的小脑细胞凋亡，可被浓度为50 μg/L、l00 μg/L的NGF缓解，因某些单核细胞能够分泌NFG。Zassler等[31]将这类单核细胞移植入模型动物体内后，研究发现，与对照组相比，移植组中通过NMDA途径导致的胆碱能神经元凋亡数目明显减少，表明NGF可通过拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性实现对神经元的保护。

3 Caspase-3与NGF中枢神经元保护作用的相关性

我们知道，发生高胆红素血症脑损伤时，可导致神经元凋亡，Caspase-3是Caspase家族中与细胞凋亡关系最密切的，并在其中发挥着重要作用，而NGF对受损的中枢神经元有明确的保护作用，为了研究中枢神经损伤时受到NGF干预后脑组织中Caspase-3的表达变化，人们进行了大量实验。葛洪亮等[32]在大鼠脊髓损伤后用蛇毒神经生长因子进行干预发现，与对照组相比，干预组损伤脊髓组织中 Caspase-3蛋白表达明显下降，差异有统计学意义。张彦等[33]用神经生长因子对红藻氨酸（KA）致癫痫大鼠进行干预，发现NGF能有效抑制其海马区Caspase-3的表达，发挥其脑损伤保护作用。有实验表明[34]，大鼠脑缺血再灌注后，脑内Caspase-3表达增多，并于再灌注后24 h达到高峰，与对照组相比，Caspase-3在NGF干预组脑组织中表达减少。也有研究表明[35]，NGF可通过下调c-jun mRNA及Caspase-3蛋白的表达，减少缺血神经元的凋亡。也有人用神经生长因子、外源性降钙素基因相关肽（CGRP）以及二者联合分别对短暂性全脑缺血后再灌注大鼠进行干预，发现NGF和CGRP均可抑制全脑缺血后大鼠纹皮质Caspase-3蛋白表达，联合应用则能显著抑制Caspase-3表达，提示NGF和CGRP通过抑制Caspase-3蛋白表达对缺血神经元起保护作用，且二者对保护缺血神经元可能有协同作用[36]。

以上结论表明：NGF可通过抑制Caspase-3的表达实现对神经元的保护，但NGF如何对Caspase-3进行作用尚不完全清楚，可能与NGF的拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性、稳定细胞内Ca2+水平及增加自由基清除剂的活性等作用有关。可以猜想，在高胆红素血症脑损伤致细胞凋亡的过程中，有Caspase-3的参与，如果用外源性NGF进行干预，有可能降低脑组织中Caspase-3蛋白的表达，从而延缓甚至阻断高胆红素血症脑损伤的发展，而有关NGF如何影响高胆红素血症脑损伤脑组织中Caspase-3表达的报道目前仍比较少，这些都有待进一步研究。

4 前景及展望

近年来，高胆红素血症脑损伤的发生发展过程及其防治措施逐渐成为研究热点，但相关报道目前仍比较少。众多体内外实验表明，过量胆红素可加速神经细胞凋亡，且Caspase-3在其中有关键作用，但具体的分子机制并不清楚，而NGF的神经元保护作用虽然明确，但其分子机制尚未完全阐明，尤其是在高胆红素血症脑损伤中，NGF对损伤脑组织中Caspase-3表达的影响及其作用机制仍需进一步研究。因此，高胆红素血症脑损伤后脑组织中Caspase-3的表达变化研究及神经生长因子的神经元保护机制研究，有助于对高胆红素血症脑损伤发生发展过程的进一步认识，有望探索出一条可行的高效准确的干预通路，以尽可能减轻过量胆红素造成的脑损伤，甚至一定程度上阻止高胆红素血症脑损伤的发展。

[参考文献]

[1] 黄德珉. 新生儿黄疸[J]. 新生儿科杂志，1995，10（4）：148-150.

[2] 孙长琴. 新生儿高胆红素血症研究新进展[J]. 海南医学，2009，20（5）：296-299.

[3] 赵瑞杰. Caspase 家族与细胞凋亡的关系[J]. 中国畜牧杂志，2010，46（17）：73-78.

[4] 袁长青，丁振华. Caspase的结构和功能[J]. 国外医学：分子生物学分册，2002，24（3）：146-151.

[5] Cohen GM. Caspase：The executioners of apoptosis[J]. J Biol Chem，1997，326（ Pt1）：1-16.

[6] Thom bcrry NA，Yuril. Caspase enemies within[J]. Science，1998，281（8）：131-135.

[7] Marks N. Caspase-9 interations in the developing nervous system：Evidence for multipie death pathway[J]. Neurochem Int，1999，35（3）：195-197.

[8] Joseph EK，Levine JD. Caspase signal lingin neuro path can din flammatory painin therat[J]. Eur J Neurosci，2004，20（11）：2896-2902.

[9] Blagosklonny MV，Chuman Y，Bergan RC，et al. Mitogen activated protein kinase pathway is dispensable for microtubule active drug induced Raf-1 Bcl-2[J]. Leukermia，1999， 13（7）：1028-1036.

[10] Dimitrov T，Krajcsi P，Hermiston TW，et al. A clenovirus protein complex inhibits tumor necrosis factor induced translocation of cytosolis phospholipase to membranes[J]. J Virol，1997，71（4）：2830-2837.

[11] Liu X，Kin CN，Yang J，et al. Induction of apoptotic program in cell free extracts：Requirement for d-ATP and cyto chrome C[J]. Cell，1996，86（7）：147-157.

[12] Krajewska S，Krajewska S，Krajewski M，et al. Release of Capase-9 from mitochondria during neuronal apoptosis and cerebral ischemia[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1999， 96（10）：5752-5757.

[13] Rodrigues CM，Sola S，Silva R. Bilirubin and amyloid beta peptide induced cytochrome C release through mitocondrial membrane permeabilization[J]. Mol Med，2000，6（11）：936-946.

[14] David G，Kirsch DG，Andrea DB，et al. Capase-3 dependent cleavage of Bcl-2 promotes release of cytochrome C[J].J Biol Chem，1999，274（30）：21155-21161.

[15] 王晓琴. 高胆红素血症新生大鼠脑组织激活素A、caspase-3表达的研究[J]. 中华神经医学杂志，2008，7（3）：262-266.

[16] 温博贵. 神经生长因子：分布、化学及功能[J]. 生理科学进展，1981，12：132-138.

[17] 于肇英. 神经生长因子的研究[J]. 生理科学进展，1988， 19（3）：226-230.

[18] Ullrich A，Gray A Berman C，et al. Human beta-nerve growth factor gene sequence highly homologous to that of mouse[J]. Nature，1983，303（5920）：821-825.

[19] 黄秉仁，蔡良琬. 神经生长因子家族及其受体研究进展[J]. 生理科学进展，1995，2：115-120.

[20] 黄莉，蒋犁，缈红军. 神经生长因子对新生大鼠脑神经元细胞缺氧缺血损伤的保护作用[J]. 中国临床康复，2005，45：82-84，198.

[21] 龙琦，尹晓娟，封志纯. 神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对缺氧缺血脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞的影响[J]. 实用医学杂志，2009，25（1）：36-39.

[22] 孔祥梅，黄飞，陈立东，等. 神经生长因子对体外培养大脑基底神经节神经元的保护作用[J]. 解剖学杂志，2007，30（2）：182-185.

[23] Ziemba KS，Chaudhry N，Rabchevsky AG，et al.Targeting axon growth from neuronal transplants alongpreformed guidance pathways in the adult CNS[J]. J Neurosc，2008， 28（2）：340-348.

[24] Jin Y，Ziemba KS，Smith GM. Axon growth across a lesion site along a preformed guidance pathway in the brain[J]. Exp Neurol，2008，210（2）：521-530.

[25] 周政，陈惠孙，张可成，等. 神经生长因子对颅脑损伤后神经细胞的保护作用[J]. 中华实验外科杂志，2004， 21（5）：588-589.

[26] 李强，王冬阳. 神经生长因子与脑缺血[J]. 锦州医学院学报，2004，25（2）：52-54.

[27] 吴俊芳，张均田. 神经生长因子对新生大鼠脑细胞内游离钙浓度的影响[J]. 中国临床药理学与治疗学杂志，1997，4：241-244.

[28] Cheng B，McMahon D，Mattson MP. Modulation of calcium current，intracellular calcium levels and cell survival by hypoglycemia，NGF and bFGF in cultured hippocampal neurons[J]. Brain Res，1993，607：275-285.

[29] Darzynkiewicz Z，Brino S，Bino GD，et al. Features of apoptotic cells measured by flow eytometry[J]. Cytometey，1999，13（5）：795-808.

[30] 王艳辉，赵冬宝，赵春玉，等. 神经生长因子对新生的大鼠小脑皮质神经细胞凋亡的影响[J]. 中国临床康复，2005，9（9）：50-51.

[31] Zassler B，Humpel C. Transplantation of NGF secreting primary monocytes. Counteracts NMDA-induced cell death of rat cholinergic neurons in vivo[J]. Exp Neurol，2006，198（2）：391-340.

[32] 葛洪亮，贺茂林，李世德. 蛇毒神经生长因子对大鼠脊髓损伤后Caspase-3表达影响[J]. 蛇志，2011，23（2）：111-113.

[33] 张彦，朱凤莲. 神经生长因子对红藻氨酸致大鼠海马神经细胞半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶-3表达的影响[J]. 实用儿科临床杂志，2010，25（4）：282-284.

[34] 张宇. 神经生长因子对大鼠脑缺血再灌注后caspase-3及AngⅡ表达的影响[D]. 大连医科大学，2008.

[35] Dacheng Jin. Nerve growth factor downregulatesc-jun mRNA and Caspase-3 instriate cortex of rats after transient globalcerebral ischemia/reperfusion[J]. Neural Regeneration Research，2006，4：289-292.

[36] 金大成，王铁民，方秀斌. CGRP和NGF对短暂性全脑缺血后再灌注大鼠纹皮质Caspase-3蛋白表达的影响[J].神经解剖学杂志，2004，20（3）：296-300.

（收稿日期：2015-09-15）