闽南地区食源性动物组织中黄曲霉毒素B1残留量调查研究

朱苏琴 张志刚＊ 叶葆衡 黄印尧,2 李国平,3

（1.厦门银祥集团有限公司肉食品安全生产技术国家重点实验室 福建厦门 361100；2.厦门出入境检验检疫局 福建厦门 361012；3.福建农林大学 福州 350002）

黄曲霉毒素（Af1atoxin，AFT）主要为真菌黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）产生的次级代谢物，主要的生物学效应是致癌、致畸及致突变作用。 现已发现的有 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1等10多种，彼此结构十分相似，都含有一个决定毒性的双呋喃环和一个与致癌有关的氧杂萘邻酮（香豆素），其中AFB1毒性最强，其毒性为砒霜的68倍，氰化钾的10倍，已被联合国列为一类致癌物[1-2]。高剂量时可导致急性死亡，低水平持续性摄入可产生慢性毒性。目前，世界上有1/4的粮食被霉菌毒素污染，其中黄曲霉毒素污染最为严重[3]，黄曲霉毒素污染已成为全球性的难题。据统计，我国黄曲霉毒素污染率达90%，其中15%～25%已达到重度污染而禁用，尤其是在气候温湿的南方地区污染尤为严重，不仅给农业经济带来巨大损失，更为严重的是，残留在动物组织中的AFT可通过食物链进入人体并富集，最终诱发肝癌、肾癌、胃癌等，严重威胁人类健康。为此，自1960年发现黄曲霉毒素以来，各国纷纷制定了黄曲霉毒素限量标准，我国饲料中黄曲霉毒素（AFB1）限量标准不超过20 ug/kg，猪肉组织中AFB1不超过5 ug/kg，而欧盟制定的标准最为严格，即猪肉组织中AFB1不超过2 ug/kg。

已有较多的研究报道了食品、饲料、花生、玉米、牛乳等黄曲霉毒素污染水平[4-7]，而直接研究动物脏器及肌肉组织内富集AFB1水平的报道极少，史莹华等[8]利用免疫亲和柱净化结合高效液相色谱法测定了组织样品中的黄曲霉毒素。本研究以气候相对潮湿的闽南地区为背景，以饲喂的食源性动物猪、鸡、鸭肝脏及肌肉组织为材料，应用酶联免疫吸附（ELISA）技术测定样品中的AFB1含量。一方面直接调查评估闽南地区食源性动物组织中AFB1的残留量，间接反映了闽南地区食源性动物饲料中AFB1的污染程度，为领导部门规范养殖业提供理论依据；除此之外，本研究还检测了国外进口猪肉中AFB1含量。

1 材料与方法

1.1 材料 检测的食源性动物组织样本均采集于闽南地区厦门、漳州、泉州各畜禽养殖场和肉品市场，鸡肝脏、鸭肝脏、猪肝脏各40份，本地土种猪肉，白毛猪肉各40份；从英国、丹麦、西班牙、加拿大进口猪肉各10份，共40份（由厦门出入境检验检疫技术中心提供）。

1.2 方法 采用酶联免疫吸附（ELISA）技术进行检测，样品的前处理与检测方法按照试剂盒（购于美国bioo scientific）进行，检测限为 0.05 ug/kg。

1.2.1 样品制备 肝脏样品制备（稀释倍数：4倍）：取适量样品研磨混匀后称取2 g于50 mL离心管中，加入6 mL乙腈和2.5 mL样品平衡液，涡旋振荡10 min，加入200 uL肝脏提取液，涡旋振荡1 min，4 000 g离心10 min。取600 uL上清液到干净离心管中，60～70℃氮气吹干样品，用800 uL的35%甲醇/PBS溶解干燥样品，涡旋混匀1 min，取50 uL作ELISA检测用。

肌肉样品制备（稀释倍数：10倍）：取适量样品研磨混匀后称取5 g于50 mL离心管中，加入25 mL 70%甲醇，摇床振荡20 min，于4 000 g室温离心10 min。取上清液以1:1的比例和PBS混合，取50 uL作ELISA检测用。

1.2.2 ELISA检测 分别加入50 uL不同浓度的AFB1标准品及待测样品于微孔板中，加入100 uL AFB1抗体，轻轻混匀1 min，室温下孵育30 min，加入250 uL Wash so1ution洗板3次，洗完后将酶标板于纸上轻拍至干，加入150 uL HRP酶标抗体，轻轻混匀1 min，室温下孵育30 min，加入250 uLWash so1ution洗板3次，洗完后将酶标板于纸上轻拍至干，加入100 uL TMB，轻轻混匀1 min，室温下孵育15 min后立即加入100 uL终止液，置于酶标仪于450 nm波长测量OD值。

1.3 数据分析 计算每个浓度标样或样品在450 nm处的平均吸光度值和空白 （标样AFB1浓度为0 ng/mL）在450 nm处的平均吸光度值，然后计算出每个浓度标样或样品所对应的AFB1（固相）与抗AFB1抗体的最大结合率（%）。

以最大结合率为纵坐标，标样浓度为横坐标制作标准曲线，样品中AFB1含量可根据该标准曲线获得。用SPSS13.0统计软件分析数据，结果以平均值±标准偏差（X±Sd）表示。

2 结果与分析

2.1 AFB1的标准曲线 以AFB1标准浓度为横坐标，最大结合率为纵坐标制得AFB1标准曲线（见图1），曲线方程公式为 Y=198.0X2-265.4X+95.09（R2=0.991），待检样的AFB1浓度值可根据所测的OD值，由标准曲线方程公式得出对应的浓度值。

图1 AFB1的ELISA标准曲线

2.2 不同动物肝脏组织中AFB1检测 不同动物组织中黄曲霉毒素B1的检测水平见表1。由表1可知，鸡、鸭、猪3种动物肝脏中AFB1的检出率分别为65%、75%、100%，超标率均为0%；平均含量分别为 （0.302 ± 0.034）ug/kg、 （0.289 ± 0.022）ug/kg、（1.498± 0.274）ug/kg。SPSS 13.0统计学分析结果表明，猪肝脏中AFB1含量最高，显著高于鸡、鸭肝脏中 AFB1 含量（P＜0.01）；鸡、鸭肝脏中 AFB1 含量相对较低，且二者之间无显著性差异（P＞0.05）。

以上检测结果说明，饲喂的食源性动物组织中AFB1含量虽未超出国家限量标准，但具有超高的检出率，均为AFB1污染。且饲喂时间较长的猪肝脏组织内的AFB1含量极显著高于饲喂时间较短的鸡鸭肝脏中 AFB1含量（P＜0.01）；这可能是由于 AFB1在动物体内的存在是一个富集的过程，因此，残留量与动物饲喂AFB1污染的饲料的时间成正比，鸡鸭的平均饲喂时间为90 d左右，而猪为180 d左右，这就不难理解猪肝脏内的AFB1残留量显著高于鸡鸭肝脏。这在一定程度上也说明了动物采食AFB1污染的饲料时间越长，AFB1在体内残留就越多，而且在肝脏中残留比肌肉多。

2.3 猪肌肉组织中AFB1检测水平 猪肌肉中AFB1检测水平见表2。由表2可知，中国与国外进口的猪肌肉中黄曲霉毒素B1的检出率均为100%，超标率均为0%。中国土猪、中国菜猪，进口猪瘦肉中AFB1的平均含量依次为 （0.811±0.497）μg/kg、（0.863 ± 0.261）μg/kg、（0.912 ± 0.051）μg/kg。 SPSS13.0统计学分析表明，国外猪肌肉中AFB1含量虽略高于国内，但均无显著性差异（P＞0.05），且都低于表1中猪肝脏内AFB1含量，表明猪肝脏内AFB1含量高于其他组织。这与杨其名[9]报道的泔水猪肝脏中AFB1含量最高，肾脏次之，瘦肉最低结果一致。以上检测结果说明，国内外饲料喂养型猪肌肉组织中AFB1含量虽未超出国家限量标准，但检出率均为100%。含量显著高于健康人。许菊萍等[14]研究表明当AFB1浓度达到1.0 g/mL时能促进肝癌细胞的增殖活动。有研究报道AFT可显著降低猪的生长性能、显著降低肝内酶活性而导致肝功能严重损伤[15]，AFB1可通过食物链富集于人体，其攻击的靶器官为肝脏，即使是微量的AFB1，若长期摄入，也具有慢性毒性，最终将导致癌症尤其是肝癌的发生。可以想象动物或人类长期大量摄入受AFB1污染的饲料或食物，后果

表1 不同动物肝脏组织中AFB1检测水平

表2 猪肌肉组织中AFB1检测水平

3 小结与讨论

1）应用酶联免疫吸附（ELISA）技术对闽南地区食源性动物（鸡、鸭、猪）肝脏和肌肉组织以及国外进口猪肉中的黄曲霉毒素B1残留量进行抽样检测。结果显示所有检测样品中黄曲霉毒素B1均具有很高的检出率，其中猪肉、猪肝均为100%、鸡肝65%、鸭肝75%，但都低于国家限量标准；猪肝脏中AFB1含量最高，显著高于猪肌肉和鸡、鸭肝脏中AFB1含量（P<0.01）；而鸡、鸭肝脏中的AFB1含量无显著性差异（P>0.05）；此外，国外进口猪肉样品中AFB1检出率100%，但未超标；Chiavaro[10]报道了源于意大利北部各农场的50份猪肝脏样本AFB1和AFM1的检测结果，所有样本AFB1含量均低于1.0μg/kg，而本研究结果显示猪肝脏AFB1平均含量为1.498±0.274 μg/kg，在一定程度上说明了我国猪肝脏内AFB1污染较国外更为严重，须给予重视。检测结果表明，食源性动物组织中黄曲霉毒素B1残留普遍存在。

2）黄曲霉毒素，尤其是黄曲霉毒素B1对人类健康的危害极大。研究表明，肝癌的发生与黄曲霉毒素污染密切相关，在已明确的肝癌致癌因素中，AFB1、HBV和HCV位居前3位[11]，尤以AFB1为著。流行病学调查显示，AFB1高污染地区肝癌的发病率明显高于低污染地区[12]，周元平等[13]以肝癌患者的肝组织为研究材料，结果表明肝癌患者肝组织中AFB1将不堪设想。

3）饲料为导致猪肉组织中黄曲霉毒素超标的极为重要的来源。我国饲料中黄曲霉毒素污染问题普遍存在，田西学等[16]报道了陕南关中地区饲料黄曲霉毒素B1检出率72.37%，超标率4%。王若军等[17]从福建、广东、内蒙古、北京、辽宁、湖南、浙江等地采集动物、植物蛋白饲料、青贮饲料、菌体蛋白饲料、玉米等进行黄曲霉毒素普查，结果表明黄曲霉毒素污染虽不严重超标，但普遍存在。业内人士都很清楚，饲养霉变饲料的家禽家畜，常常出现家禽曲霉菌病害，保育舍小猪、中猪出现阴户肿胀的假发情症状等，还会导致呼吸与消化系统的疾病，机体免疫力下降，生长缓慢。

4）要去除食源性动物组织中AFB1残留问题，首先要解决饲料霉变这个全球性问题。近年来，霉菌毒素脱毒处理技术成为研究热点，主要有物理、化学、生物方法，可以使霉菌毒素不同程度去除或者失活，物理、化学脱毒法存在“二次污染”问题，而生物脱毒法成为一种更为安全有效的去除黄曲霉毒素的方法，如黄曲霉毒素解毒酶、乳酸菌、葡甘露聚糖等[18-20]都能在一定程度上起到解毒的作用，但至今还没有一种较为理想、经济、有效的好方法。面对饲料霉菌污染问题，首先要加强饲料防霉的防范意识，在饲料原料管理、储存、运输加工等环节必须严格把关，做好防霉措施。从源头上预防霉菌的侵害，这是当前最有效的防治方法。

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