液相色谱-串联质谱法测定鸭肉中四环素类药物残留

江秀红 福建省农产品质量安全检验检测中心 福州 350003

四环素类抗生素（TCs）是由链霉菌产生的一类广谱抗菌药，主要有四环素（TC）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、多西环素（DOTC）和美他霉素（METC）等[1]，在畜禽生产中被广泛用于药物添加剂，用于防治肠道感染和促生长，容易诱导耐药菌株和导致食品残留。四环素、土霉素和金霉素是我国应用最广、应用时间最长的动物保健性抗生素，一些不法分子为了经济效益，常滥用这类药物，致使在动物性食品中大量残留，不仅危害人体健康，而且更为严重的是畜禽产品中残留高浓度的土霉素、金霉素和四环素容易诱导各种致病菌产生耐药性，不利于对人类和畜禽类疾病的治疗。欧盟及我国均规定动物组织中四环素类抗生素的最大残留限量为：肾0.6 mg/kg、肝 0.3 mg/kg、肌肉 0.1 mg/kg[2]。

目前用于该种药物的检测方法有：微生物法、薄层色谱法、分光光度法、化学发光法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等[3]。已有的方法存在灵敏度不高、前处理繁琐或重现性不好等问题，很难满足对药物残留的确证检测[4]。本方法选用鸭肌肉组织为分析对象，建立了一种检测四环素类药物的快速、简便、灵敏度高的液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）方法，可以满足当前该类药物的残留检测。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 Waters2695 Quattro micro液质联用仪（美国WATERS公司）；高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；固相萃取装置（美国Supe1co公司）；旋转混合器（IKA公司）；PL203电子天平（瑞士Mett1er-to1edo公司）；氮吹仪（美国 OA-SYS公司）；酸度计 PB-21（美国Orion公司）；Sep-pak C18 6CC萃取小柱（500 mg）。

四环素、土霉素和金霉素的盐酸盐标准品购自中国兽医药品监察所，纯度＞99.5%；甲醇、乙腈为默克公司的色谱纯；甲酸为美国ACS恩科公司的色谱纯；柠檬酸（含一个结晶水）、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠均为分析纯；所用水为屈臣氏瓶装纯净水。

1.2 试验方法

1.2.1 标准储备液配制 分别取盐酸四环素、盐酸土霉素和盐酸金霉素对照品适量，精密称定。按四环素、土霉素和金霉素计，用甲醇溶解并稀释成浓度均为1 mg/mL的溶液，作为标准储备液。置-20℃冰箱中保存。

1.2.2 四环素、土霉素和金霉素工作液 精密量取标准储备液适量，用甲醇-水（3:7，V/V）溶液稀释成适宜浓度的四环素、土霉素和金霉素标准工作液。

1.2.3 McI1vaine-Na2EDTA缓冲液 分别取柠檬酸12.9 g，磷酸氢二钠10.9 g，乙二胺四乙酸二钠37.2 g，加水900 mL溶解，用1 mo1/L氢氧化钠溶液调pH值至4.0±0.5，加水稀释至1 000 mL，即得。

1.2.4 样品前处理方法 称取均质的鸭肌肉组织2.0 g，置于50 mL离心管中，加入McI1vaine-Na2EDTA缓冲液8 mL，涡旋充分混匀，10 000 r/min离心10 min（温度为4℃），取上清液于另一离心管中。重复提取一次，合并上清液，经快速滤纸过滤后备用。Sep-pak C18固相萃取柱依次用甲醇5 mL、水5 mL预洗。取备用液8 mL过柱，用3 mL10%甲醇水溶液淋洗，减压抽干。用5 mL5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮气吹干（温度低于40℃）。最后用甲醇-水 （3:7）1.0 mL溶解残留物，过滤膜后作为试样溶液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3 色谱条件 色谱柱：Xbridge C18 2.1*150 mm，粒径5μm。流动相A为0.3%甲酸乙腈溶液；B为0.3%甲酸水溶液。柱温：35℃，进样体积20μL，流速：0.2 mL/min。流动相梯度洗脱条件见表1。

1.4 质谱条件 采用电喷雾正离子检测；毛细管电压：3.8 kV；锥孔电压：25 V；离子源温度 110℃；雾化温度：350℃。质谱参数见表2。

表2 四环素、土霉素、金霉素质谱参数

2 结果与分析

2.1 标准曲线 分别精密量取标准储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mL 置于 10 mL 容量瓶，稀释成含四环素、 土霉素和金霉素分别为 5、 10、20、50、100、200、400 ng/mL 的溶液，见表 3。

2.2 方法的检出限和定量限 将标准溶液用样品空白基质稀释后进样，进样量为20μL，以信噪比为3倍时的溶液浓度为检出限，由此得出四环素、土霉素、金霉素的检出限 （LOD）分别为 5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL，结果见表3。以信噪比为10倍的溶液溶度为定量限，称样量为2.0 g，前处理后定容至1.0 mL，则四环素、土霉素、金霉素的定量限均为20 ng/mL。

表3 方法的线性范围、检出限和回归方程

2.3 方法的精密度和准确度试验 取经检测四环素、土霉素、金霉素含量低于检测限度的鸭肉，分别添加一定浓度的标准溶液，相当于50、100和200 ug/kg （即 1/2的 MRLVDs、MRLVDs和 2倍 的MRLVDs）3个浓度水平，每个浓度5组平行样，按1.2.2所述方法提取制备后进行处理，进行回收率试验和精密度试验，回收率均在80.6%～106.3%，RSD均在0.6%～4.2%，符合方法学要求，结果见表4。

3 结 论

本研究建立了鸭肉中四环素类抗生素的定性和定量方法。样品在4℃条件下高速冷冻离心，可以较好地去除油脂类杂质，同时，收集液用快速滤纸过滤，极大地加快了固相萃取小柱的净化洗脱速度，整个前处理过程具有分离度高、快速的特点，最后用甲醇-水溶解残余物，可以确保样品溶液的稳定性和检测的灵敏度。

采用该方法，检测了南方樱桃谷肉鸭生态养殖技术集成与示范项目的鸭肉192批次，结果均未检测出该类药物，说明该方法可用于实际样品的测定。

表4 精密度与加标回收试验（n=5）

[1]滑静,王建立,张淑萍.动物性食品中四环素类药物残留的检测方法[J].药物检测,2004,21（7）:26-33.

[2]李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析[M].上海:上海科学技术出版社,2002:365.

[3]刘艳华,张纯萍,门立强,等.液相色谱-串联质谱法测定鸡肌肉组织中的四环素类药物残留 [J].色谱,2005,24（2）:171-173.

[4]蔡英华,薛毅,张玥,等.UPLC-MS/MS法测定动物源性食品中四个四环素类药物和10个受体激动剂类药物残留[J].药物分析杂志,2014,34（7）:1223-1230.