心肌肥厚小鼠心肌组织Beclin1的表达及其意义

张明娟，张超英，杨 军，朱参战，段宗明，宋安齐(西安交通大学医学院第二附属医院心内科，西安70004;西安交通大学医学院第二附属医院病理科;通讯作者，E-mail:zhangmingjuan@mail.xjtu.edu.cn)

心脏是一个具有可塑性的器官，在高血压或心肌梗死、长时间段的心率加快、收缩期和舒张期缩短、心肌收缩力持续增强等病理生理状态下，心脏能通过心肌形态的重塑(cardiac remodeling)以适应环境的变化，保证强有力的心脏搏动，满足全身器官的血供和血压的维持。心肌细胞常常会发生代偿性心肌肥厚［1］，表现为心肌纤维肥大、收缩力增强，并伴有心肌纤维间胶原纤维过量积聚、胶原浓度显著升高/胶原容积分数显著增加等心肌纤维化过程［2］。一旦上述病理状态继续存在，则会引起心室逐渐扩张，心肌收缩功能下降，最终表现出一系列临床症状，发展成为多种心脏疾病。研究已知，自噬是维持内环境稳态的重要分子机制，在心脏损害中可能具有双重作用。在上述病理生理状态下，心肌细胞既能通过激活自噬提高心肌细胞对缺血缺氧的耐受能力，也可抑制细胞自噬减少细胞死亡、避免过度自噬对心脏的损害。但具体作用还取决于自噬激活作用的水平及诱导环境。但是，自噬在心肌肥厚中的具体作用机制并不清楚。因此，研究自噬在心肌肥厚的分子机制对于心脏疾病的防治具有重要意义。

而自噬(autophagy)最早由Ashford和Porter在1962年发现，现已证实，自噬是细胞实现自身物质代谢、细胞器更新的生理过程，是真核生物中进化高度保守的对细胞内物质进行循环再生利用的重要生理现象，几乎参与所有细胞的生理和病理过程［3］。研究证实，采用神经刺激因子或不同药物，例如儿茶酚胺、野百合碱、慢性低氧、持续抑制一氧化氮合酶、增加压力及心肌梗死等方法制备不同类型的心肌肥厚动物模型，为研究心肌肥厚病理生理过程提供了坚实的实验基础。其中采用异丙肾上腺素制备的心肌肥厚模型［4］，因其与人类心肌肥厚更为相似而应用最为广泛。因此，本研究拟采用皮下包埋微量泵持续泵入去甲肾上腺素(isoprenaline，ISO)方法建立小鼠心肌肥厚模型，检测自噬相关蛋白Beclin1在心肌组织中的表达，探讨自噬在心肌肥厚发生中的作用，为心肌肥厚以及心力衰竭机制的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

ALZET微渗透泵(Model 2004，美国ALZA公司)。异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)系美国Sigma产品。Beclin1抗体购自美国Santa Cruz Biotech公司。免疫组织化学试剂盒(Dako REAL EnVision Detection System)购自丹麦Dako公司。

1.2 心肌肥厚模型的建立

选用20只WT雄性小鼠，购自西安交通大学医学院动物实验中心。完全随机化分为实验组和对照组:实验组为 ISO 小鼠(微量泵，ISO 30 μg/(g·d)，n=10)，对照组为假手术组(微量泵，0.9%NaCl，n=10)。方法 如下［4］:戊巴比妥(20 mg/kg)腹腔内注射麻醉，将小鼠俯卧于手术台上，背部除毛，75%酒精消毒，埋入微量泵后缝合皮肤(ISO组埋入已预装ISO 30 μg/(g·d)微量泵，对照组埋入已预装0.9%NaCl微量泵)。所有小鼠均喂标准颗粒饲料，自由饮水，术后饲养4周，超声心动图学检查后，断脊髓处死小鼠，常规取心脏，10%福尔马林固定、石蜡包埋，备用。

1.3 超声心动图检查

分别在实验开始时和术后饲养4周时对小鼠进行超声心动图学检查:将小鼠麻醉仰卧位固定，前胸除毛，手术前1周、术后4周行超声心动图(SIEMENS SEQUOIA 512)检查(探头15L8)，清晰显示胸骨旁左室长轴切面，M型二尖瓣腱索水平测量舒张末期左室内径(LVDd)、收缩末期左室内径(LVDs)、室间隔(IVSd)、左室后壁(LVPW)、左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS)及速率矫正的纤维缩短率(Vcfc)。超声仪所用技术参数对所有的测试对象相同，并至少测量3个连续周期，取其平均值。

1.4 小鼠心肌Masson染色

心肌组织常规切片脱蜡后水化，先后苏木素染色，丽春红酸性品红液中染;1%磷铝酸中染，滴加苯胺蓝液后烘干，二甲苯透明树胶封片。进行心脏间质纤维化的分析与评价。阳性结果判定标准:胶原纤维呈蓝色，胞核呈蓝色，肌纤维胞质呈红色。

1.5 免疫组织化学染色

按照Dako REAL EnVision免疫组织化学试剂盒说明书操作:常规脱蜡水化，滴加3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，滴加抗Beclin1抗体，室温孵育30 min，滴加ChemMate EnVision+/HRP，室温孵育30 min，DAB显色，苏木精复染、酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片。用 PBS代替一抗作阴性对照。Beclin1免疫组化检测结果按照胞质型分子判读标准进行判读:胞质型 0(阴性):无着色;弱阳性(+):≤10%的细胞呈现不同程度的细胞质着色;阳性(++):10%-30%的细胞呈现强的棕褐着色的细胞质着色或≤70%的细胞呈现弱或中等强度的细胞质着色;强阳性(+++):＞30%的细胞呈现强的棕褐着色的细胞质着色或＞70%的细胞呈现中等强度细胞质着色［5］。

1.6 统计学分析

用SPSS14.0进行统计分析。两组间差异分析采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌肥厚模型的建立

ISO皮下泵入4周后，小鼠的组织重量的检测结果显示，心脏/体重、肺脏/体重ISO组较对照组升高，而且差异存在统计学意义(P＜0.005，见表1)。然而，两组间肝脏/体重、肾脏/体重以及脾脏/体重未见明显的统计学差异。结果 提示心脏重量增加，心肌肥厚发生;肺脏重量增加，提示可能存在肺脏的轻度淤血。

2.2 超声心动图检测结果显示

LVPWs、LVEF、FS、Vcfc 两组间差异有统计学意义(P＜0.005，见表2)。组织重量和超声结果均提示，ISO持续皮下微量泵入4周后，小鼠心脏组织出现了心肌肥厚。

表1 两组间小鼠的组织重量与体重比值的比较(±s)Table 1 Com parison of tissue/body weight between ISO group and control group(±s)

表1 两组间小鼠的组织重量与体重比值的比较(±s)Table 1 Com parison of tissue/body weight between ISO group and control group(±s)

组别 n 心脏/体重 左心室/心脏 肺脏/体重 脾脏/体重 肾脏/体重 肝脏/体重ISO 组 9 0.51 ±0.03* 0.71 ±0.02 0.55 ±0.04*0.28 ±0.02 1.28 ±0.12 4.13 ±0.29对照组 10 0.43 ±0.03* 0.71 ±0.03 0.49 ±0.02* 0.27 ±0.03 1.40 ±0.12 4.42 ±0.59 t-5.217 0.545 -3.163 -0.350 2.095 1.326 P 0.000 0.593 0.006 0.731 0.051 0.202

表2 两组间小鼠超声心动图的相关指标的比较(±s)Table 2 Comparison of echocardiography between ISO group and control group(±s)

表2 两组间小鼠超声心动图的相关指标的比较(±s)Table 2 Comparison of echocardiography between ISO group and control group(±s)

组别 n IVSd LVPWd LVPWs FS LVEF Vcfc ISO 组 9 0.07 ±0.01* 0.13 ±0.02 0.10 ±0.02* 69.73 ±7.44＊＊ 94.12 ±2.40＊＊ 16.05 ±4.50＊＊对照组 10 0.06 ±0.01* 0.08 ±0.01 0.08 ±0.01* 34.30 ±3.90＊＊ 70.18 ±5.06＊＊ 5.91 ±0.85＊＊t-3.091 -0.352 -3.085 -13.332 -14.643 -10.132 P 0.006 0.005 0.006 0.000 0.000 0.000

2.3 小鼠心肌胶原纤维Masson三色染色

小鼠左室心肌组织Masson三色染色的结果显示:对照组小鼠心肌组织呈橘红色、排列规则，其间散在少量胶原纤维(图1A见第501页);ISO组小鼠橘红色心肌纤维细胞可见小灶状脂肪变性及坏死，并伴以星网状蓝色胶原纤维增生(图1B见第501页)。

2.4 自噬相关蛋白Beclin1在ISO小鼠心肌组织中表达的意义

自噬相关蛋白Beclin1在ISO小鼠心肌组织较阴性对照组表达明显减弱，而且结果还显示，心肌纤维化越重，自噬相关蛋白Beclin1在心肌组织中的表达越弱(图2，见第501页)。因此，实验结果提示，自噬相关蛋白Beclin1参与了心肌纤维化的进程，在心肌重塑中起着重要的作用。

3 讨论

心肌肥厚是心力衰竭的前驱病变，而心脏后负荷增加导致的心肌细胞肥大、心肌肥厚及心脏功能异常是常见心脏病及相关疾病的病因。因此，探明心肌肥厚发生和发展机制一直是心血管领域最为重要的研究内容之一。采用异丙肾上腺素制备的心肌肥厚模型，因其小剂量持续给予ISO可兴奋心肌细胞肾上腺素β1受体，使心肌收缩力增强、心率加快、收缩期和舒张期缩短，还可引起的整合素连接激酶(丝氨酸/酪氨酸的蛋白激酶，ILK)、p-PI3K和p-Akt蛋白表达上调、PI3K/Akt信号通路激活［6，7］，可进一步激活细胞抗凋亡机制、葡萄糖代谢及蛋白合成等过程，同时，通过激活蛋白激酶PKC和PKA途径共同激活Raf和ERKI/2，促进环磷腺苷生成和糖原合成，促进心肌组织成纤维细胞的存活、增殖和心肌细胞内总蛋白和非收缩蛋白合成增加，最后导致不依赖于后负荷的促心肌肥大效应和心肌肥厚的发生，而发展成为病理性心肌肥厚［8］。还有学者证实采用磷脂酰肌醇3-激酶C(PI3KC)小分子抑制剂AS605240对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥厚和纤维化具有一定的改善作用［9］。因此，PI3K/Akt信号通路激活，被认为可能是导致心肌肥厚的机制之一。

正因如此，本研究采用ISO小鼠心肌肥厚模型以探讨自噬在心肌肥厚中的作用和意义。结果 显示，采用皮下包埋微量泵连续输注ISO 4周后，ISO实验组小鼠心脏指数明显高于对照组，同时，超声结果显示:ISO实验组小鼠尽管LVPW明显增厚，但FS亦未见明显降低。同时采用了与负荷相关性较小的LV功能指标，比如:人体速率矫正的纤维缩短率(rate-corrected velocity of fiber shortening，Vcfc)，应用于与负荷不相关的收缩功能状态的描述［10］。与短轴缩短率相比，Vcfc能更好地反映前负荷与心率无关的生理变化。结果 显示，实验组的Vcfc明显高于对照组，提示其收缩功能正常。同时，还发现其肺脏/体重的比值明显高于对照组，但尚未表现出明显的气短、气促、双下肢浮肿等症状，说明ISO诱导的心肌肥厚模型成功建立，其实验小鼠心功能状态仍处于代偿期。说明，采用微量泵持续输注ISO是短期内建立小鼠心肌肥厚模型的可靠方法。

心肌细胞自噬不仅是心肌细胞正常生理的反应，更是对各种心血管刺激的适应性调节反应，同时还参与心肌肥厚、心肌梗死、心力衰竭等各种心血管疾病的发生发展。Beclin1是一个非常保守的自噬相关蛋白，与Vps30/Atg6同源，既是Bcl-2结合蛋白，也是三型磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KC)复合物1(Vps34、Vps15 Vps30/Atg6和 Atg14)、复合物 2(Vps34、Vps15 Vps30/Atg6和Vps38)的重要组分之一［11，12］。PI3KC 是唯一高度保守的 PI3K 亚型，在自噬调节中发挥重要的调节作用。Beclin1通过其BH3结构域与Bcl-2和Bcl-2家庭其他成员(Bcl-XL，Bcl-w Mcl-1)结合，其中Bcl-2/Beclin1被认为是自噬调解的一个关键的调节机制［13-15］。Mst1通过对Beclin1蛋白BH3域的thr108苏氨酸的磷酸化增强Beclin1和Bcl-2/Bcl-xL结合的稳定性［16］。还有学者证实机体可通过Beclin1依赖性和非依赖性机制调控自噬细胞死亡［17，18］。

该研究结果也表明，ISO组小鼠肥厚的心肌组织中自噬相关蛋白Beclin1表达实验组较对照组表达明显减弱，同时，心肌组织Masson三色染色结果也提示肥厚的心肌组织发生了纤维化改变。显然，在连续小剂量输注ISO引起小鼠心肌肥厚病程的进展和纤维化程度与Beclin1的表达呈负相关。这一现象也被其他学者所证实［19］。例如，有学者发现在心脏压力过负荷时心肌蛋白合成及心脏肥厚的概率增加，但自噬活性却降低［20］。Yamaguchi等［21］发现，主动脉缩窄(TAC)所引起的压力过负荷可导致野生型鼠功能正常的心脏肥厚的同时自噬活性降低。此外，特异性抑制心脏自噬相关蛋白ATG5及ATG7或心脏细胞自噬基因Atg5缺失小鼠，可在抑制心肌自噬、损伤蛋白积累的同时，导致左侧心室扩张和收缩功能障碍及典型心肌肥厚，继而引起扩张型心肌病及HF。

如前所述，小剂量持续给予ISO引起的PI3K/Akt信号通路活化，被认为可能是导致心肌肥厚的机制之一。PI3K/Akt/mTOR and AMPK信号通路是自噬和凋亡调节的重要因子。同时，抗凋亡信号如PI3K/Akt/mTOR信号通路和Bcl-2可抑制自噬。而促凋亡信号，如AMPK信号通路和Bax可活化自噬PI3KC抑制剂3-methyladenine(3-MA)抑制 PI3KPTEN-Akt-mTOR 信号通路诱导自噬［12，22］。可见，PI3K/AKT/mTOR通路还可通过负反馈调解机制精确调节细胞自噬活性，以应对不良环境刺激，维持细胞生存能力［20，23，24］。

由此，本课题组推测在ISO诱导的心肌肥厚中，心肌肥厚时自噬相关蛋白表达下调可能与PI3K/Akt信号通路的活化有关，同时也是心肌细胞应对持续小剂量输注ISO输注引起的不良血流动力学反应的保护性反应，利于心肌细胞的存活，但是其详细机制仍有待进一步研究。

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