结肠癌组织中凋亡抑制基因Livin的表达及临床意义

叶 芸，李苏亮，郑乃青(西安医学院第一附属医院中心实验室，西安 710077;通讯作者，E-mail:yeyun236@163．com)

结肠癌是在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的消化系统恶性肿瘤。近年来，关于结肠癌的基础和临床研究已取得很大进步，但病因学和发病机制尚未完全阐明。肿瘤的发生、发展与细胞增殖和细胞凋亡失衡有关，是多基因参与过程。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是一类内源性凋亡抑制因子家族，其过度表达引起细胞凋亡缺陷与肿瘤发生密切相关［1］。Livin基因是IAP家族成员，已有研究表明Livin基因是某些肿瘤诊断和治疗的潜在靶点［2］。然而，Livin基因在结肠癌发病中的作用、恶性侵袭和转移的表达，以及是否可作为早期诊治的靶点鲜见报道。本文通过研究凋亡抑制基因Livin在结肠癌组织中的表达及临床意义，旨在探讨Livin表达在结肠癌的临床诊断及病情评估中的作用。

1 材料和方法

1．1 研究对象

收集西安医学院第一附属医院肿瘤外科2009－02－10～2012－06－31已行手术切除并经病理确诊的结肠癌新鲜标本96例，术前均未接受过化疗或放疗治疗，女性32例，男性64例，年龄38－72岁，平均年龄(57±7．12)岁。结肠癌TNM分期采用AJCC标准(2010)，组织分型采用Lauren分型，结果显示病理类型:高分化癌17、中分化癌26例，低分化癌53例;出现淋巴结转移者42例，未出现转移54例;TNM分期:Ⅰ－Ⅱ期35例，Ⅲ－Ⅳ期61例。对照组:选取30例癌旁正常结肠组织(距肿瘤边缘5 cm以上组织)。将每次所获得的新鲜组织的一部分保护于RNA Waiter中，后存放于－80℃冰箱中，用于RT-PCR，另一部分新鲜组织经10%甲醛固定，石蜡包埋常规连续切片，用于免疫组织化学检测。

1．2 主要试剂与仪器

Trizol购于美国Sigma公司;逆转录试剂盒购于大连TAKARA生物科技公司(日本);puc19 Marker购于美国MBI生物科技公司;Taq酶购于日本Toyobo公司;PCR反应的引物由北京鼎国生物技术有限公司合成。

1．3 免疫组织化学染色检测Livin蛋白表达

即用型鼠抗人单抗(珠海市泉晖企业有限公司)按SP法进行免疫组织化学染色。DAB显色，苏木精衬染，常规脱水、透明、封片。用PBS代替一抗进行染色，作为阴性对照;用已知各抗体的阳性对照片作阳性对照。实验结果评定标准:Livin染色阳性信号呈棕黄色细胞颗粒状，主要定位在细胞质中，在100倍光学显微镜下随机选取5个视野，然后采用Image-Proplus5．0分析软件在400倍光镜下对阳性表达进行定量分析，计算每个视野阳性染色的积分光密度(integral optical density，IOD)值，取5个视野IOD的均值为各组最终数据。

1．4 RT-PCR检测Livin mRNA水平

Livin基因上游引物:5’－CCTGGTCTGTGCTGAGTGT－3’(上游)，5’－CTGGTCAGTGCTGGATGGA－3’(下游)，产物长度为 214 bp。10×buffer 5 μl、dNTP 4 μl、cDNA 5 μl、上下游引物各 5 μl、Tap酶 1 μl、PCR 用水 29 μl共 50 μl。PCR 反应条件:94℃5 min、94℃1 min、58℃1 min退火、72℃延伸2 min共29循环。72℃10 min延长。

1．5 统计学分析

选择结肠癌患者的性别、年龄、浸润深度、肿瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴结转移及远处转移等与临床相关的因素，将Livin在各因素之间的表达情况行统计学分析。所有实验数据采用SPSS17．0软件系统分析所有数据，两组积分光密度值以±s表示，采用两样本t检验进行分析;分类变量采用χ2检验或确切概率法进行分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 免疫组化染色结果

Livin染色的阳性物质呈棕黄色，表达于细胞膜、胞质(图1，见第504页)。结肠癌组积分光密度值为147．67 ±5．09，对照组积分光密度值为112．68 ±4．51，两组比较差异有统计学意义(t=24．31，P ＜0．05)。

2．2 RT-PCR检测结果

96例结直肠癌组织中77例Livin mRNA表达阳性(见图2)，阳性率为80．2%，呈高表达;30例对照组正常结肠组织1例表达阳性，阳性率为3．3%，呈低表达。两组比较差异有统计学意义(χ2=57．28，P ＜0．05)。

图2 结肠癌组织、正常结肠组织中livin基因电泳条带图Figure 2 Electrophoresis banding of Livin gene in colon cancer tissue and normal colon tissue

2．3 Livin与结肠癌患者临床病理特征的关系

将96例患者的各项临床相关资料行统计学分析，结果显示:Livin基因表达与TNM分期、分化程度及浸润深度有关，两组间差异有统计学意义(P＜0．05)，与性别、年龄、肿瘤病灶大小、是否有远处转移、有无淋巴结转移均无关(P＞0．05，见表1)。

表1 Livin基因表达与临床病理特征的关系 例(%)Table 1 The relationship between Livin expression and clinical pathological features cases(%)

3 讨论

近年，结肠癌已成为我国发病率增长最快的恶性肿瘤之一，其发病率增长了100%。每年大约有14万人新患结肠癌，占全部癌症患者的6．8%。IAP是一类内源性细胞抑制因子，其过度表达引起细胞凋亡不足与肿瘤发生密切相关［3］。Livin是IAP成员，Ashhab等［4］经序列分析显示Livin蛋白质有两种剪切异构体，长度分别为1 321 bp及1 267 bp，分别称为Livin α及Livin β。Livin基因位于人染色体20q13．3，全长4．6 kb，包含 7 个外显子和 6 个内含子。Livin在N端含有一个BIR结构域，C端含有一个RING结构域。Livin BIR包含4个α螺旋、1个三股的反平行β片层以及相应的氨基酸残基共同构成的疏水核心。Livin α cDNA全长897，编码298个氨基酸;Livin β cDNA全长843，编码280个氨基酸。Livin α与β，除了在BIR与RING间相差18个氨基酸外，两者结构非常相似，两者相差的18个氨基酸由介于BIR和RING结构之间的第6外显子5’端54的基因序列编码。Livin在胚胎组织中存在，在胎儿发育过程中多种组织高表达，在正常成人的大多数终末组织中(除胎盘)低表达或不表达，正常大肠组织中无 Livin基因的表达［5－7］。

随着对多种肿瘤中Livin的研究，显示Livin在很多肿瘤组织中表达，如在黑色素瘤、人子宫颈癌Hela细胞、人肝癌细胞、非小细胞肺癌细胞、白血病T细胞、鼻咽癌上均有显著性过表达现象［8，9］，这些研究结果提示，Livin的表达可能是维持肿瘤细胞在体内生长的重要因素。最近研究还发现在消化道肿瘤中，如胃癌、胰腺癌及肝癌中均见Livin呈过度表达［10］。

肿瘤的发生、发展与细胞增殖和细胞凋亡失衡有关，是多基因参与过程。已有研究表明，Livin基因是某些肿瘤诊断和治疗的潜在靶点［11］。然而，Livin基因在结肠癌发病机制中的作用、恶性生物学行为(侵袭和转移)的表达，以及是否可作为早期诊断及治疗的靶点鲜见报道。本实验采用免疫组化及PCR技术检测了Livin基因在结肠癌组织及正常结肠组织中的表达情况，发现Livin基因在结肠癌组织中高表达，在正常结肠组织中低表达;Livin基因表达与TNM分期、分化程度及浸润深度有关，与性别、年龄、肿瘤病灶大小、是否有远处转移、有无淋巴结转移均无关。因此，检测Livin基因在结肠癌组织中的表达对结肠癌的临床诊断及病情评估有重要作用。

［1］Kim KS，Zhang L，Williams D，et al．Discovery of tetrahydroisoquinoline-based bivalent heterodimeric IAP antagonists［J］．Bioorg Med Chem Lett，2014，24(21):5022－5029．

［2］Lee DH，Yoon TM，Kim SA，et al．Relationship between expression of Livin and the biological behavior of human oral squamous cell carcinoma［J］．Oncol Rep，2014，32(6):2453－ 2460．

［3］Pop C，Salvesen GS．Human caspases:activation，specificity，and regulation［J］．J Biol Chem，2009，284(33):21777 –21781．

［4］Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al．Two splicing variants of a new inhibior of apoptosis gene with different different biological properties and tissue distribution pattern［J］．FEBS Lett，2001，495(1－2):56－60．

［5］Kasof G M，Gomes BC．Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］．J Biol Chem，2001，276(5):3238－3246．

［6］Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al．ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］．Curr Biol，2000，10(21):1359－1366．

［7］Lin JH，Deng G，Huang Q，et al．KIAP，a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family［J］．Biochem Biophys Res Commun，2000，279(3):820－831．

［8］Crnkovic-Mertens I，Hoppe-Seyler F，Butz K．Induction of tumor cells by siRNA-mediated silencing of the Livin/ML-IAP/KIAP gene［J］．Oncogene，2003，22(51):8330－8336．

［9］Tanabe H，Yagihashi A，Tsuji N，et al．Expression of survivin mRNA and Livin mRNA in non-small-cell lung cancer［J］．Lung Cancer，2004，46(3):299－304．

［10］Yagihashi A，Asanuma K，Tsuji N，et al．Detection of anti-Livin antibody ingastrointestinal cancer patients［J］．Clin Chem，2003，49(7):1206－1208．

［11］Myung DS，Park YL，Chung CY，et al．Expression of Livin in colorectal cancer and its relationship to tumor cell behavior and prognosis［J］．PLos One，2013，8(9):e73262．