富含γ-氨基丁酸水牛乳酸奶的研制

谢芳，杨承剑，唐艳，农皓如，杨攀，曾庆坤

（中国农业科学院广西水牛研究所，南宁530001）

0 引言

γ-氨基丁酸（y-Amino Butyric Acid，GABA），是一种非蛋白质氨基酸，具有激活脑内葡萄糖代谢、降血氨、降血压、活化肝、肾功能，改善更年期综合症等生理功能[1]。乳酸菌因具有益生功能，可以增强人体免疫力，提高食品的营养价值[2-3]利用其发酵条件优化等措施而生产富含GABA的乳制品已成为目前研究的热点[4]。富含GABA的发酵乳中的γ-氨基丁酸、乳酸菌增殖因子等，能显著调节机体机能，起到防病治病的作用[5-6]。水牛乳作为南方地区特有的乳制品，其营养价值颇高，本试验利用从水牛乳中分离出的高产GABA的乳酸菌为出发菌株，将其应用到水牛乳酸奶的发酵中，研制富含GABA的功能性酸奶，为今后水牛乳系列产品的深加工提供理论依据。

1 实验

1.1 材料

新鲜水牛乳：于当天取自水牛研究所种牛场，白砂糖（市售）。

酸奶菌种：德氏乳杆菌保加利亚亚种（1.2717 Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus），嗜热链球菌（1.2718 Streptococcus thermophilus），产γ-氨基丁酸乳酸菌种（自水牛奶中分离所得），经鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种，实验室保存。

培养基及试剂：基础培养基为脱脂后的水牛乳，MRS培养基，MRS肉汤培养基，L-谷氨酸单钠盐，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器设备

SPX-150生化培养箱，YM50立式压力蒸汽灭菌器，5804R高速冷冻离心机，LNG-T88台式快速冷冻离心机，尼康ECLIPSE 50i正置生物显微镜，SW-CJ-1F超净工作台，THZ-82A恒温振荡器，美国FTC-质构仪（TMS-Pro），HI8424便携式pH检测仪，乳脂分离机，美的冰箱等。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

生水牛乳→净化→均质→配料→杀菌→接种（按实验条件）→发酵→后熟

1.3.2 检验方法

（1）乳酸菌的检测方法。采用平板计数法测定活菌数[7]。

（2）pH值的测定。用HANNA（意大利哈纳）HI8424便携式酸度测定。

（3）GABA测定。产GABA菌种及混合发酵剂，空白对照酸奶及样品酸奶GABA的测试均直接送检至广西分析测试中心完成。

（4）酸度测定参考GB 5413.34-2010[8]。

（5）感官评价。根据GB19302-2010标准的感官评定要求[9]，请实验室5位同事对实验所得产品进行感官评分，评分标准[10]如表1所示：

表1 GABA酸奶的感官评定标准

1.3.3 实验方法

（1）发酵剂的制备 菌种的选择。本研究采用从生鲜水牛乳中筛选出的一株高产GABA乳酸菌，与传统酸奶菌种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为出发菌株，先将其用MRS肉汤培养基活化，再用脱脂水牛乳传两代后扩大培养至稳定期，收集菌体，再将这三种菌株按体积比1∶1∶1制成混合菌种，用于发酵制备富含GABA的水牛乳酸奶。

（2）单因素及正交实验。分别对菌种选择、配比、L-Glu等底物的添加量、发酵温度等因素对酸奶品质及GABA产量的影响进行分析，将确定的四个单因素设计成L9（34）的正交实验[11]，以期得到GABA水牛乳酸奶的最佳发酵条件。

1.3.4 数据分析

采用SPSS17.0统计软件进行正交结果方差分析；其它数据计算、绘图采用Microsoft Excel 2003。

2 结果与分析

2.1 菌种的选择

本研究对同等发酵条件下，采用传统菌种（保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌）发酵的普通酸奶和采用产GABA的乳酸乳球菌单菌发酵的酸奶分别进行GABA质量分数的检测，结果发现普通酸奶中无GABA存在，而单独利用乳酸乳球菌发酵的酸奶，其产GABA的量均在0.005 mg/g左右，将此单菌按不同的质量分数分别添加于灭菌水牛乳中于37℃发酵，其凝乳时间、酸度、GABA质量浓度及组织状态，如表2所示。

表2 产GABA乳酸菌单菌发酵情况

由表2可以看出，若采用此单菌发酵酸奶，按接种量9%，其凝乳时间要最短也要16.5 h，不利于工业化生产，且其酸度值均在70以下，不符合发酵乳的酸度要求标准[9]。本研究选择采用混菌方式发酵，以提高酸奶的发酵效率和品质。

2.2 L-Glu添加量对含GABA水牛奶酸奶的影响

因谷氨酸钠（L-Glu）是GABA产生的前体物质[12]，而加入谷氨酸钠会对酸奶的风味造成一定影响，但为富集更多的GABA，在考虑其对酸奶影响最小的范围内加入3‰，5‰，7‰，9‰，11‰质量分数的谷氨酸钠，在37℃培养，待酸奶达发酵终点后，测定其GABA的质量浓度，结果如图1所示。

图1 谷氨酸钠添加量对酸奶产GABA量的影响

由图1可以看出，当谷氨酸钠的添加量在5‰左右时，其酸奶中GABA质量浓度最高，当添加量在6‰至10‰时，GABA质量浓度处于平缓，随着酸奶中L-Glu的不断消耗，GABA的质量浓度也呈上升趋势，故从酸奶风味、GABA质量浓度两方面综合考虑，选择谷氨酸钠添加量为3‰～6‰最为合适。

2.3 发酵条件优化

本研究在单因素试验的基础上，对底物添加量、发酵温度等作进一步优化，采用L9（34）平进行正交实验，待酸奶达到发酵终点后放入4℃冰箱，测定其在24 h后GABA的质量浓度。分析各因素对酸奶GABA产量的显著性差异，结果如表3～表5所示。

表3 正交实验因素水平

表4 正交实验结果与分析

表5 正交实验结果方差分析

由表4可以看出，4个因素对酸奶GABA产量的影响顺序为：L-Glu添加量（C）＞混合菌种配比（B）＞乳酸乳球菌的接种量（A）＞发酵温度（D）。正交实验结果表明，富含GABA酸奶的最优工艺组合为A1B2C3D2，即乳酸乳球菌的接种量为3%，混合菌种配比为 1∶0.5∶1，L-Glu 添加量为 6‰，发酵温度为37℃。

由表5可以看出，只有C因素L-Glu添加量与酸奶GABA产量差异显著（P＜0.05），因素A乳酸乳球菌的接种量、B混合菌种配比、D发酵温度均与酸奶GABA产量差异不显著（P＞0.05）。

最后对组合A1B2C3D2进行验证实验，成品酸奶中GABA的质量浓度为0.7 g/L，且产品组织状态良好，口感清爽，酸甜适中，感官评分为91分。

2.4 贮存过程中乳酸菌活菌数及pH值的变化

分别检测储存于4～8℃的普通水牛乳酸奶与含GABA水牛乳酸奶的pH值及乳酸菌活菌数，其变化情况如图2所示。由图2可以看出，在保质期内，GABA酸奶的乳酸菌活菌数及pH值均明显高于普通酸奶，这说明产GABA乳酸菌对酸奶中的乳酸菌总菌数有一定的促进作用。在第8天时乳酸菌活菌数保持在108mL-1以上，符合发酵乳活菌数的要求标准[9，13]；8天内其pH值均在4.0以上，说明其后酸化是可控的[14-15]。

图2 贮存期间乳酸菌菌落对数（lg）和pH值变化

2.5 产品的质量指标

2.5.1 感官

表面光滑、呈乳白色，具有水牛乳酸奶特有的滋味、气味，组织细腻、均匀，有少量乳清析出，无异味。GABA酸奶与普通酸奶在口感、酸度、组织状态等方面均无明显差异。

2.5.2 理化、微生物

酸奶的理化、微生物指标如表6和表7所示，均符合GB 19302-2010《发酵乳》质量要求。

表6 GABA酸奶的理化指标

表7 GABA酸奶的微生物指标

3 结论

（1）从生水牛乳中分离出的产GABA的乳酸乳球菌，按适当的比例与传统酸奶菌种混合，可应用于水牛乳酸奶的发酵，其产品中GABA质量浓度高，且感官良好，各项理化、微生物指标均符合国家标准。

（2）当产GABA乳酸乳球菌的接种量为3%，乳球菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌配比为1∶0.5∶1，L-Glu添加量为6‰，发酵温度为37℃时，所得产品的感官及组织状态最佳，且GABA质量浓度最高可达0.7 g/L。

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