植物乳杆菌发酵玉米低聚肽乳饮料的研制

李婷,任欢,满朝新,赵思雨,张立冬,李理,刘少敏,姜毓君

（东北农业大学a.食品学院；b.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150030）

0 引言

近几年GABA由于其多种多样的益生功能受到人们的关注。GABA具有降血压[1-2]、抗抑郁和减肥等功效[3]。其需求量也在逐年增加，人们通常采用乳酸菌发酵添加了谷氨酸的食物发酵而得来[4-6]。但是，味精味过重影响了其产业化应用。

玉米低聚肽是从玉米蛋白经水解获得的小分子多肽功能性物质，富含谷氨酸（16%）,[7]，其中谷氨酸正是γ-氨基丁酸合成的前体。

大多数研究只是把玉米低聚肽经调和后直接制成饮料[8,9]，本研究创新地将玉米低聚肽作为发酵底物，利用分离自内蒙古通辽地区传统的乳制品中的具有高产GABA能力的植物乳杆菌NDC75017进行发酵，制得富含GABA的活菌型乳饮料,并对其发酵工艺及脱苦工艺进行初探，不但解决了传统GABA发酵乳制品味精味过重的问题，还有利于玉米深加工原料的应用和发展。

1 实验

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌NDC75017分离自内蒙古通辽地区传统发酵乳制品。

甜玉米市售；玉米肽由山东天骄生物技术有限公司提供：甜乳清粉由河南金润食品添加剂有限公司提供。

MRS液体培养基：蛋白胨5 g,牛肉膏5 g,酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,Tween-80 1 mL,葡萄糖 20 g，磷酸氢二钾2 g,柠檬酸氢二铵2 g,乙酸钠5 g,硫酸镁0.5 g,硫酸锰0.25 g，蒸馏水定容至1 000 mL,调pH值至5.8。121℃灭菌15 min，用于菌体的活化。

MRS固体培养基：MRS液体培养基添加质量浓度为20 g/L的琼脂粉，121℃灭菌15 min，用于菌体的计数。

食品级活性炭、β-环糊精和碱性蛋白酶。

γ-氨基丁酸标品（Sigma公司）及色谱级甲醇和四氢呋喃

1.2 主要仪器与设备

BCN1360型生物洁净工作台，GL-21M高速冷冻离心机，DHP-9082型电热恒温培养箱，Waters 2695 GPC高效液相仪；Hypersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，分析天平，灭菌锅，精密天平，精密pH计。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

从-80℃取出植物乳杆菌NDC75017复苏纯化。30℃，14 h活化两代后用质量浓度为8.5 g/L氯化钠溶液清洗两次，重新悬浮于饮料基质中，配置成母发酵剂，使得菌株活力维持在109mL-1左右。

1.3.2 玉米汁的制备

水果玉米脱粒清洗，用沸水预煮5 min,再按照料液比=1∶3的比例磨浆，最后90℃灭菌30 min后，冷却备用。

1.3.3 玉米肽的制备

玉米肽的制备参考李鸿梅等人的方法并稍有改动[10]。简要叙述如下：将玉米蛋白粉过60目筛后，利用质量浓度为40 g/L的碳酸钠以16 mL/g的添加量添加后在40℃下脱脂处理10 min后离心留取沉淀，在将沉淀与水和碱性蛋白酶按照沉淀∶水∶碱性蛋白酶=50∶500∶1的比例混合，再在50 ℃下酶解4 h，酶解pH=8.0，酶解结束后在90℃下灭酶15 min，离心保留上清液。

1.3.4 发酵

以3%（v/v）的接种比例将母发酵剂分别接种于以下两种发酵底物：饮料基质A：质量浓度80 g/L的甜乳清粉、体积分数为50%上述玉米肽和浓度为20 μmol/L的磷酸吡哆醛。饮料基质B：质量浓度为80 g/L%甜乳清粉、体积分数为50%上述玉米汁和浓度为20 μmol/L磷酸吡哆醛；30℃发酵68 h后，4℃下备用。

1.3.5 玉米肽脱苦实验

酶法水解得到的玉米肽会产生苦味，产生苦味的物质是一些短肽类的苦味肽，常常采取活性炭吸附法或者β-环糊精包埋法去除苦味物质。根据赵晨霞和隋玉杰的方法稍作改动去除苦味[11,12]，简要步骤如下，活性炭吸附组：在玉米肽中添加质量浓度为100 g/L过100目筛的活性炭粉，调节pH值至3.0，30℃吸附2 h，并定时搅拌，转速为5 000 r/min离心10 min留上清；β-环糊精包埋组：在玉米肽溶液中添加质量浓度为20 g/L的β-环糊精，50℃包埋30 min,并定时搅拌。将脱苦处理后的玉米肽作为底物发酵，并观察各指标的变化。

1.3.6 GABA检测

将发酵液离心（4℃，10 000 r/min，20 min）保留上清，通过0.45 μm的滤膜后上机检测，参考薛玉清等人的检测方法[13]，主要是利用GABA与邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde,OPA）发生衍生反应生成具有较强紫外吸收性的物质，该衍生物溶于流动相溶液，并可用C18反相高效液相色谱柱分离。检测过程如下：样品与衍生试剂按1∶10比例充分混合后，室温静置反应1 min,0.22 μm滤膜过滤，运用Waters 2695-2487高效液相色谱系统检测。其中流动相为醋酸钠缓冲液（0.05 mol/L）∶V（甲醇）∶V（四氢呋喃）=50∶49∶1；流速为1 mL/min；紫外检测波长为338 nm；柱温为30℃。

1.3.7 活菌计数

利用平板计数法计算发酵后的菌体数量。将发酵液进行梯度稀释，选择合适梯度进行平板涂布，30℃培养48 h计数。结果用活菌数对数（mL-1）表示。

1.3.8 感官评定

结合饮料常用的感官评定标准及发酵玉米肽乳饮料的特点，感官评定标准如表1所示[9]。

表1 感官评定标准

1.3.9 贮藏稳定性

以质量浓度为80 g/L的甜乳清粉和体积分数为50%的脱苦后的玉米肽为基质制备发酵乳饮料饮料。观察饮料在4℃下冷藏21 d内的GABA及活菌数的变化。

1.3.10 统计分析

试验过程每组做3个平行；采用SPSS 17.0统计软件进行显著性差异分析；数据计算、绘图采用Microsoft Excel 2007。

2 结果与分析

2.1 玉米肽的制备

经过酶解处理后的酶解液澄清、溶解性良好，略有苦味。可以用于后续的发酵试验。

2.2 饮料基质种类选择

植物乳杆菌NDC75017在含玉米肽和玉米汁的不同基质中，发酵后的GABA和活菌数如图1所示。菌株在甜乳清+玉米肽的基质中GABA产量显著地高于甜乳清+玉米汁组，达到15.97 mg/100 mL,说明玉米肽比玉米汁更有利于GABA的积累。这是由于GAD酶对于谷氨酸盐底物的偏好性[14]，上述基质中L-谷氨酸盐的含量正是玉米肽＞玉米汁。其中玉米肽和玉米汁中的L-谷氨酸盐是由乳酸菌在发酵过程中水解得到的。由于玉米肽中氮源含量充足，所以菌体活力在玉米肽中较高，但口感较玉米汁差。基于益生功能及口感的综合考虑，选择甜乳清和玉米肽作为发酵基质，并对其脱苦工艺进行初探。

图1 玉米汁与玉米肽对于GABA和活菌数及口感的影响

2.3 玉米肽脱苦

基于图1感官评定的结果，为了提高玉米肽的口感，对玉米肽进行脱苦处理。玉米肽采用活性碳吸附和β-环糊精包埋处理后，发酵后的GABA、活菌数及口感如图2所示。两种处理对于菌体活力没有显著影响，但是活性碳处理组GABA的积累显著低于β-环糊精处理组，有报道证实其与氮源大量损失有关[11]。两种处理方法均可达到去除苦味的效果。

图2 活性炭及β-环糊精脱苦效果的比较

2.4 GABA的含量水平及贮藏稳定性

以质量浓度为80 g/L的甜乳清粉和体积分数为50%脱苦后的玉米肽为基质制备饮料在4℃贮藏21 d里GABA及活菌数变化如图3所示。由图3可以看出，在贮藏期间GABA及活菌数都稍有减少，但是，GABA仍在（10～12）mg/100 mL以上，可以起到益生作用。活菌数也维持在107mL-1以上，高于国家标准（106mL-1）。

图3 4℃下贮藏21天GABA及活菌数变化

3 结论

实验以分离自内蒙古传统发酵乳制品中具有高产GABA能力的乳酸菌Lactobacillus plantarum NDC75017为发酵剂，通过比较口感、活菌数和GABA，选择酶解法获得的玉米肽和乳清粉为发酵基质，发酵制得富含GABA的乳饮料。实验对玉米肽的脱苦方法进行研究，结果表明两种处理方法均可以达到脱苦效果并且对于菌体活力没有显著影响，但是活性炭处理组GABA的积累显著低于β-环糊精处理组，因此选择β-环糊精作为脱苦剂。饮料贮藏2 1d后GABA可以维持在14 mg左右。乳酸菌的活菌数在贮藏21 d后可以维持在107mL-1以上，高于国家标准（106mL-1）。研究证实酶法水解制备的玉米肽可以作为乳酸菌发酵底物，并且其发酵饮料可以获得益生物质GABA以及一定数量的乳酸菌，为以后玉米肽发酵饮料的进一步研发提供了一定基础。

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