乳源性小肽QEPV的抗衰老功能研究

高扬，唐祎，钱蕙佶，沈鹏，占东升，梁世排，张少辉，3

（1.上海交通大学农业与生物学院，上海200240；2.浙江熊猫乳业集团股份有限公司,浙江 温州325800；3.上海交通大学陆伯勋食品安全研究中心，上海200240）

0 引言

生物活性肽具有易被吸收、毒性小等特点，且在促进机体自身免疫等方面有着良好的前景，所以被视作新兴药物候选者[1-2]。目前，已经发现一系列生物活性肽，如细胞调节肽、抗氧化肽等[3-9]。

衰老与机体的稳态机制的逐渐丧失紧密相关[10]，人们先后提出自由基学说、端粒学说、氧化-炎症衰老学说等多种假说，其中自由基学说是非常重要的学说之一[11-15]。近年来，越来越多的人认为免疫因素、遗传因素、环境因素都会对机体的衰老产生影响[16]。金赢凯等通过实验证明本研究室发现的生物活性肽具有很好的抗氧化活性[17]。周婕慧等已经证明从牛奶发酵乳中提取的小肽QEPV能够提升小鼠的抗炎症能力，并提高小鼠体内的多种还原酶活性，从而提高机体的抗氧化能力，缓解机体因炎症而引起的氧化应激状态[18、19]。

本文以果蝇为实验模型，从果蝇的多种指标的变化来研究QEPV对果蝇抗氧化能力的影响，并探讨了其潜在机理。

1 实验

1.1 材料与仪器

实验动物：Oregon K野生型黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），由上海交通大学农业与生物学院遗传学实验室提供。

实验条件：采用普通玉米培养基培养，温度（25±1）℃，相对湿度45%～75%，每2天更换新鲜培养基一次。

实验试剂：琼脂粉，购自国药；蔗糖，过氧化氢，MDA脂质过氧化物试剂盒，SOD超氧化物歧化酶试剂盒，乳源生物活性肽QEPV（委托上海淘普生物科技有限公司合成，纯度＞98%）。

实验仪器：Mettler-Toledo电子分析天平，上海恒科GRX-9072A型电热恒温鼓风干燥箱，Thermo超低温冰箱，Tecan Pro-200酶标仪，力康RO15纯水系统，Eppendorf离心机，LRH-250F生化培养箱，上海元象生物科技有限公司组织匀浆器。

1.2 方法

1.2.1 果蝇生存实验

以果蝇为实验模型：收集8 h内新羽化的果蝇成虫，麻醉后分雌雄随机转移到各实验组中，每组每个性别100只，每组设置3个平行，对照组给予普通玉米粉培养基，实验组分别为含有质量浓度为0.05，0.5，1 g/L的QEPV生物活性肽-玉米培养基。每2天更换新鲜培养基1次，每天观察并记录不同性别果蝇的死亡数，直到果蝇全部死亡为止。绘制果蝇生存曲线，并计算出不同性别果蝇的平均寿命和最高寿命（取最后死亡的5只果蝇进行统计）。

1.2.2 繁殖力测定实验

收集8 h内新羽化的果蝇成虫，将其雌雄分开喂养，培养基中分别加入质量浓度为0，0.05，0.5，1 g/L的QEPV溶液，连续培养12 d。第13天收集相同浓度下培养的成年果蝇并转移到新的普通培养瓶中，每个培养瓶保证1只雌性和2只雄性（每组5瓶），每瓶给予准确的24 h进行产卵。产卵后将亲本果蝇转移到新的普通培养瓶中，旧培养瓶继续繁殖培养，待幼虫羽化后统计后代数量，连续测定7，并重复3次。

1.2.3 过氧化氢急性毒性实验

选取寿命实验中结果较好的肽浓度培养基，设置空白对照组和实验组，每组雌雄性别果蝇均为50只，其它条件与寿命试验一致，对果蝇培养3周。然后同时将果蝇重新分组，每组取5只雄性和5只雌性果蝇转移到一个新的容器中，新的容器内含有一个纸质圆盘，圆盘同时加入300 μL终浓度为5%的蔗糖溶液以及质量分数为30%过氧化氢1mL，空白组和实验组均暴露在这种过氧化氢产生的毒性过氧化物环境中，每组设置10个平行样，观察其抗氧化能力。每4小时记录果蝇死亡数量和性别，直到果蝇全部死亡。

1.2.4 果蝇超氧化物歧化酶 （SOD）活性和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）浓度测定

实验设计同寿命延长实验设计，饲养30 d后，每组称取果蝇40 mg，加0.5 mL生理盐水，在冰浴中研磨匀浆，间歇10 s，反复进行3次，制成匀浆，按照试剂盒说明测定每组果蝇SOD活性及MDA浓度。利用MDA检测试剂盒检测果蝇体内的脂质过氧化产物MDA的浓度，分光光度计的波长为532 nm。

1.2.5 统计学处理

利用SPSS 19.0统计学软件进行统计学分析，所有数据用均采用平均值±标准偏差的形式表示。多组间比较采用单因素方差ANOVA中的LSD法进行显著性分析，并以P＜0.05认为具有统计学意义。

2 结果与讨论

衰老是生物体随着时间的推移而发生的必然现象，主要表现在机能的不断衰退、适应能力和抵抗力的不断减退。外界的不良环境刺激可使衰老过程加速,而在生物体自身的衰老过程中活性氧自由基也是一个不可忽视的因素[20]。目前已经报道的诸多延缓衰老的活性物质，大多数都是通过对自由基的抑制来实现其作用。

2.1 果蝇生存实验结果

本研究对喂食不同质量浓度生物活性肽的果蝇寿命的研究结果如图1所示。由图1（a）可以看出，相对于空白对照组雄性果蝇而言，喂食质量浓度为0.05 g/L的QEPV并没有显著改变雄性果蝇的存活率，而当肽质量浓度达到0.5 g/L和1 g/L时，相同时间点，雄性果蝇的存活率有了明显提高；由图1（b）可以看出，相对于空白对照组雌性果蝇，喂食质量浓度为0.5 g/L和1 g/L时，在相同时间点，雌性果蝇的存活率有所提高，但结果差异不明显。

图1 不同质量浓度的QEPV对果蝇存活率的影响

由表1可以看出，相对于空白对照组，低剂量组雄性果蝇平均寿命没有明显变化，但中剂量组和高级量组雄性果蝇平均寿命均有提高，分别为15.44%和9%，但仅中剂量组产生了显著性差异（P＜0.05），说明中剂量组雄性果蝇的平均寿命显著性提高。同时，中剂量组和高剂量组果蝇的半数死亡时间得到了提高，但最长寿命方面均未有明显差异。

表1 QEPV对雄性果蝇寿命的影响

表2 QEPV对雌性果蝇寿命的影响

由表2可以看出，雌性果蝇低剂量组、中剂量组和高剂量组在平均寿命方面均有所提高，但均未产生显著性差异。但中剂量组和高剂量组的最长寿命均有所提高，较空白对照组分别延长7和6，并产生了显著性差异（P＜0.05）。Yuneva等[21]研究发现，一定浓度的肌肽能够显著提高果蝇平均寿命，但当质量浓度更高时，果蝇的平均寿命并没有显著性增加。Kyu-Sun Lee[22]等在对姜黄素延长果蝇的寿命实验中也同样发现，果蝇寿命延长与所用姜黄素浓度以及果蝇品系、性别等有着密切关系。Hyung-Lyun Kang[23]等也发现果蝇寿命延长与受试药物浓度、受试果蝇品系有关。本实验结果说明，生物活性多肽QEPV在一定浓度下可以提高果蝇的平均寿命和最长寿命，但与浓度和性别有关。这种与受试物浓度、品系相关的现象可能是因为QEPV参与果蝇的部分生物代谢，或者是通过改善果蝇组织的抗氧化体系来达到延长果蝇寿命的效果。由于不同品系果蝇的代谢会有区别，从而造成结果的差异。而性别的差异，可能是由于雌性果蝇本身就具有一定的保守性和对外界环境的抵抗力，所以QEPV对雌性果蝇寿命延长并不明显，Yuneva等[21]人的研究也发现，肌肽仅延长了雄性果蝇寿命，而雌性果蝇未出现显著性差异，这也说明雌性果蝇对外界刺激的抵抗力高于雄性。本研究中雌性果蝇空白对照组与雄性果蝇空白对照组之间的平均寿命差异也证明了这一结论。

2.2 繁殖力测定实验结果

生物体在维持机体正常机能和繁衍后代过程中都需要消耗能量及物质，两者之间存在相互竞争的关系，而寿命长短则是这两者平衡后的结果。Partridge[24]等曾报道生殖和寿命经常呈负相关，且在实验室条件下，通过抑制生育率可以提高寿命。Jagan[25]等也曾证明线虫生命周期与相互交叠的小分子调控有着密切联系，同时也说明，对于很多生物，生殖能力与机体寿命长短的变化是呈负相关的。为了验证实验中果蝇寿命延长是QEPV直接作用结果还是QEPV诱导产生的二级生理效应所导致的，因此进行了果蝇的繁殖力实验。

表3 繁殖力测定实验结果

由表3可以看出，低浓度实验组繁殖力与对照组相比未产生显著性变化，但中剂量实验组和高剂量实验组果蝇的繁殖力与空白对照组相比有显著提高（P＜0.05）。说明一定浓度的QEPV能够促进果蝇的繁殖力。Minou[26]等曾利用果蝇模型来研究繁殖力与长寿之间的关系，发现在果蝇模型中，果蝇的繁殖力与长寿是有拮抗作用的。本实验结果表明，果蝇寿命的延长是QEPV直接作用的结果，而非QEPV通过降低繁殖力所产生的二级生理效应。同时也说明QEPV对果蝇是安全的，没有毒性危害。

2.3 过氧化氢急性毒性实验结果

图2 过氧化氢（H2O2）急性实验

长寿的机体一般来说可以抵抗饥饿、氧化、各种环境压力。过氧化氢产生的羟自由基是一种化学性质最活泼的活性氧，可以造成蛋白质产生损伤、DNA突变、引起脂质过氧化，并且会造成许多生物分子、细胞、组织的氧化损伤[27]。羟自由基在体内会普遍且迅速的通过提取氢、加成或电子转移方式与诸多物质或组织进行反应，具有破坏性强、非特异性、反应迅速等特点[28]。为了评估生物活性多肽QEPV是否能够提高果蝇对外界环境中过氧化物的抵抗力，我们进行了过氧化氢急性毒性实验。从图2（a）中可以看出，对于雄性果蝇，经过QEPV喂食后，在各个时间点，雄性果蝇的存活率均高于未经QEPV喂食的果蝇，且存活时间较空白对照组有所提高，说明喂食QEPV后，雄性果蝇抗氧化能力有所提高。图2（b）中，喂食QEPV的雌性果蝇，在高浓度的过氧化氢环境中15h内存活率明显高与对照组，说明这段时间雌性果蝇抗氧化能力有所提高。但后期实验组和对照组存活曲线基本重合，说明喂食QEPV的雌性果蝇的抗氧化能力逐渐减弱，经过一定时间后与对照组没有差异。此实验结果表明，QEPV可以提高果蝇的抗氧化能力。这与已经报道的QEPV抗氧化能力实验结果一致[29]。

过氧化氢酶是动物在进化过程中形成的抗氧化酶体系的重要一员[30]，其可以很好地清除生物体在呼吸过程中产生的H2O2。李津[31]等报道紫甘薯提取物可以通过调节过氧化氢酶来抑制H2O2产生的氧化损伤，从而提高果蝇的寿命。根据H2O2急性毒性实验结果，可以推测QEPV可能通过调节CAT活性来提高果蝇对H2O2损伤的抵抗能力。

2.4 果蝇SOD活性和MDA含量测定结果

表4 QEPV对果蝇SOD、MDA的影响

SOD是生物体内一种非常重要的清除超氧自由基的酶，它可以将超氧自由基转换为过氧化氢，进而利用过氧化氢酶和过氧化物酶将过氧化氢分解，从而形成抗氧化的链。同时，生物体内产生的自由基会攻击脂质，使其发生过氧化，从而产生MDA，最终对其他物质产生损伤，造成机体衰老。因此，通过测定果蝇体内SOD和MDA浓度可以判断物质的抗氧化能力[32]。

由表4中可以看出，相对于空白对照组，小肽处理组雌雄果蝇体内的SOD含量均有提高，且对于雄性果蝇组而言，在肽质量浓度达到1 g/L时，果蝇体内的SOD含量出现显著性差异，而雌性果蝇组则在肽质量浓度为0.5 g/L和1 g/L时出现显著差异。说明通过摄入一定的小肽，可以提高体内的SOD含量，并帮助机体保护自身防止氧化损伤。

在SOD的基础上，进一步探讨果蝇体内MDA浓度，由表4可以看出，实验组雄性果蝇和雌性果蝇体内的MDA浓度均有降低。相对于雄性空白对照组MDA浓度（1.37±0.21）μmol/L，质量浓度为0.5 mg/mL和1 mg/mL果蝇组的MDA浓度出现显著性的降低，而雌性果蝇组中，在1 mg/mL质量浓度肽处理时，果蝇体内的MDA浓度出现显著性的降低。由于MDA是体内脂质过氧化而生成的，其浓度的降低间接地说明果蝇的抗氧化酶系活力得到了提高，从而保护机体组织器官不会产生大量脂质过氧化物。

从实验结果可以看出，SOD和MDA的实验结果相互佐证，可以说明小肽有助于提高机体体内的抗氧化酶系的活力，从而能有效提高机体的抗氧化能力，减少机体受不良因子的刺激，从而降低机体老化、衰老和生病机率；总体来看，对于雄性果蝇的作用要好于雌性果蝇。

3 结束语

通过对果蝇生命时间、抗氧化生理生化指标、繁殖能力变化等指标的研究，从清除氧自由基的角度探讨了乳源性小肽QEPV抗氧化和抗衰老的效果及机理。实验结果表明，一定量的乳源性小肽QEPV可以提高果蝇寿命，并可以通过提高果蝇体内抗过氧化酶系的活力，增强机体抵抗外源性氧化刺激的功能，降低机体组织中过氧化物的产生来延缓果蝇的衰老，这些结果将QEPV清除自由基和抗氧化、抗衰老功能从机理上统一了起来。实验结果中，QEPV的抗衰老作用并没有随着浓度的提高而增大，这一现象在很多抗氧化、抗衰老药物中也存在，可能原因是QEPV的饲喂时间长，其被果蝇吸收利用量是有一定限制的，且作用效果温和而缓慢；同时衰老是一个极其复杂的过程，自由基学说只能部分解释衰老过程，QEPV可能也会通过参与机体生物代谢来实现抗衰老，这可能造成了只有适宜的浓度下，果蝇的寿命延长最大。QEPV具体的抗氧化与抗衰老机制有待进一步研究。

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