响应曲面法优化木香有效成分的微波辅助提取工艺

张 玲，李 丽，王金莉

（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州 121001）

木香为菊科云木香属植物木香的干燥根，具有调中宣滞，行气止痛，解痉、松弛平滑肌、抗炎等作用，兽医临床常用其改善反刍动物瘤胃环境，治疗瘤胃积食（魏华，2012）。木香主要的活性成分为木香烃内酯和去氢木香内酯，均属于倍半萜内酯，是木香质量控制的主要指标 （国家药典委员会，2010）。响应面分析法（RSM）是利用中心组合试验拟合出完整的二次多项式模型以优化工艺条件的方法（Li，2005）。通过求出的最佳参数，使得试验设计与结果表达更加优良，最优组合条件也更直观、更精确（范东斌等，2014；王万中，2004）。 本研究采用微波辅助提取法提取木香中的木香烃内酯和去氢木香内酯，动用响应面法对提取工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津株式会社）、EZChrom色谱工作站、UV-2550紫外分光光度计（日本岛津株式会社）、水浴锅（天津中环科技电子公司）、BP121S电子分析天平（德国赛多利斯）、DFY-200型粉碎机（温岭大德中药粉碎厂）、微波提取装置HWC-10B（广州兴兴微波设备有限公司）。

1.1.2 试药 木香，购自甘肃陇原中药材开发有限责任公司；木香烃内酯标准品，来自中国药品生物制品鉴定所（批号：111524-201203）；去氢木香内酯标准品，来自中国药品生物制品鉴定所 （批号：111525-201205）；乙醇为医用级；其他化学试剂为国产分析纯；水为双蒸水。

1.2 方法

1.2.1 木香烃内酯和去氢木香内酯的含量测定

1.2.1.1 对照品的制备 分别取木香烃内酯对照品和去氢木香内酯对照品适量，精密称取，加甲醇溶解，分别配制成每毫升中含1 mg木香烃内酯和1 mg去氢木香内酯的对照品储备液。分别从其中精密吸取1 mL至量瓶中，加甲醇定容至10 mL，即得含有木香烃内酯（100 μg/mL）和去氢木香内酯（100 μg/mL）的混合对照品溶液。

1.2.1.2 标准曲线的绘制 采用HPLC分析1.2.1.1中的混合对照品溶液，采用ZORBAX SBC18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μ），流动相为甲醇-水（65∶35），检测波长为 225 nm，流速为 1 mL/min，进样量为 3、5、10、15、20、25、30、35 μL，测得峰面积积分值。以峰面积积分值（A）为纵坐标，对照品溶液的进样量（C）为横坐标，绘制标准曲线，得木香烃内酯和去氢木香内酯回归方程和线性范围：

Y=0.263X-6.435（r=0.9995）；

进样量为72.42～914.07 ng时与峰面积有良好的线性关系。

1.2.1.3 木香有效成分的提取及提取率计算 参考钱伟（2013）的提取方法，取木香饮片，适当粉碎，精密称取3.0 g木香，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，静置12 h，选取适当微波功率和提取时间，损失的重量用甲醇补足，放冷，滤过。按1.2.1.2项的测定方法，结合回归方程计算得到木香烃内酯和去氢木香内酯的质量，再计算提取率：

提取率=提取液中木香烃内酯和去氢木香内酯的质量/投药量×100。

1.2.2 单因素试验 本试验分别选取微波功率、提取时间和料液比作为考察的单因素，按照1.2.1.3方法提取，并计算提取率。

1.2.2.1 微波功率对提取率的影响 在提取时间7 min、料液比 1∶15（g/mL）的条件下，研究微波功率（200、300、400、500、600 W）对提取率的影响。

1.2.2.2 提取时间对提取率的影响 在微波功率400 W、料液比 1∶15（g/mL）的条件下，研究提取时间（3、5、7、9、12 min）对提取率的影响。

1.2.2.3 料液比对提取率的影响 在微波功率400 W、提取时间7 min的条件下，研究料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]对提取率的影响。

1.2.3 响应曲面试验设计 在单因素试验结果的最优水平基础上，根据Box-Behnken设计原理，以提取率（Y）为响应值，选取微波功率（W）、提取时间（min）和料液比（g/mL）三个影响因素，利用Design Expert 7.0软件设计三因素三水平的响应曲面试验（张百霞，2013）。因素及水平见表1。

表1 响应曲面优化试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 微波功率对提取率的影响 由图1可见，随微波功率的增加，木香烃内酯和去氢木香内酯的提取率逐渐增大，当微波功率达到400 W时，二者的提取率最高，之后逐渐下降，故考虑选用400 W微波功率为宜。

图1 微波功率对提取率的影响

2.1.2 提取时间对提取率的影响 由图2可知，随着提取时间的延长，木香烃内酯和去氢木香内酯的提取率也随之增大，在9 min时达到最大。随着微波时间的继续延长，提取率则有所下降。考虑选择微波时间为9 min。

图2 提取时间对提取率的影响

2.1.3 料液比对提取率的影响 由图3可知，随着料液比的升高，两种成分的提取率逐渐增加，但当料液比超过1∶15（g/mL）以后，提取率又迅速下降，故选择 1∶15（g/mL）的料液比为宜。

图3 料液比对提取率的影响

2.2 响应曲面优化试验 响应曲面优化试验的取值见表2，共15个试验点（3个中心点）用来估计试验误差（何力等，2010）。每次木香烃内酯和去氢木香内酯提取率见表2。

表2 响应曲面优化工艺方案及结果

2.2.1 回归方程 利用软件对表2的试验数据进行二次多元回归拟合，得到模型的二次多元回归方程。

提取率 （Y）/%=2.12+0.015A+3.750×10-3B+0.035C-9.804×10-4AB-0.025AC-0.017BC-0.14A2-0.10B2-0.060C2。

2.2.2 回归模型方差分析 对木香烃内酯和去氢木香内酯回归模型进行方差分析，结果见表3。模型的P＜0.01；模型的校正确定系数R2＞0.95；料液比的一次项和三个因素的二次项对木香提取物的提取率有显著影响（P＜0.05）；微波功率、提取时间的一次项和三个因素的交互项对两种物质提取率的影响不显著。

回归模型的响应曲面见图4。图4a表明，当提取时间比较短时，微波功率对木香烃内酯和去氢木香内酯提取率的影响比较显著，表现为曲线较陡；随着提取时间的延长，微波功率增大，提取率先增高后降低。图4b表明，两种物质的提取率随着微波功率和料液比的增加先快速增加，而后略有减小，等高线图表明，两因素的交互作用较强，影响显著。图4c表明，在微波时间为9～11 min、料液比为 1∶18～1∶14（g/mL）时，木香烃内酯和去氢木香内酯提取率可达到最大值。

表3 响应曲面回归模型方差分析

图4 两因素交互作用对木香提取物提取率影响的响应曲面图

2.2.3 最优工艺条件确定及验证试验 利用Design-Expert软件分析提取木香烃内酯和去氢木香内酯的最优条件为：微波功率402.76 W、提取时间 9.49 min、料液比 1∶16.41（g/mL），此时模型预测木香烃内酯和去氢木香内酯的提取率为2.12%。考虑实际操作，将实验条件修改为微波功率403 W、微波时间 9.5 min、料液比为 1∶16.5（g/mL），并在此修正条件下进行了3次平行验证试验，木香烃内酯和去氢木香内酯提取率的平均值为2.08%。

3 讨论

在单因素试验中，木提取物的提取率随着微波功率的增加先增大后减少，分析可能是过高微波功率会使分子运动加剧，导致木香中所有成分的溶出均增多（董发明和白喜婷，2008），从而使木香烃内酯和去氢木香内酯所占比率下降；而提取率随微波时间发生变化的原因可能上述相同。料液比对提取率的影响结果表明，提取率先是随着料液比增加而提高，在超过1∶15后又有所下降，分析可能是甲醇体积的适当增加可以使木香烃内酯和去氢木香内酯更充分溶出，但当甲醇过多时，一些醇溶性杂质的溶出量也随之增多 （朱珠和冷进松，2010），因此提取率又下降。

本试验通过响应曲面法考察微波功率、提取时间和料液比对木香提取物提取率的影响。二次多元方程模型的回归差异极显著（P＜0.01）；失拟项P＞0.05，不显著；模型的校正确定系数R2大于0.95，说明响应值的98.62%来源于所选变量，以上结果说明回归方程拟合程度良好，可以很好地描述考察因素与响应值之间的真实关系。

在修正条件下分三次提取木香烃内酯和去氢木香内酯，实际提取率为2.08%，与预测值仅差0.04%；三次提取率的RSD为1.272%，表明利用响应曲面法得到的优化结果具有实用价值。

4 结论

微波法提取木香中木香烃内酯和去氢木香内酯的最佳工艺条件为：微波功率403 W、提取时间9.5 min、料液比 1∶16.5（g/mL）。在最佳工艺条件下的提取验证试验表明，木香中木香烃内酯和去氢木香内酯的提取率为2.08%。

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