桂花残渣中总黄酮的提取及抗氧化作用研究

刘军海， 李志洲， 王俊宏， 郑 楠

（陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西汉中 723000）

天然植物黄酮具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌等生理作用，能够维持肠道菌落平衡，提高机体免疫力，促进动物生长，降低料肉比。除此之外，还具有类雌激素作用，可提高动物繁殖能力，而且安全无毒（占今舜等，2014；陈佩佩等，2012）。 研究发现，桂花残渣中含有丰富的黄酮类化合物，如果将这一资源利用起来作为饲料添加剂的来源，不仅降低了饲料成本，也提高了桂花的综合利用价值（朱沛沛等，2012；王丽梅等，2012）。本试验研究了微波预处理对酶解法提取桂花残渣总黄酮的影响，通过正交试验优化了提取工艺条件，并对其抗氧化活性进行研究，旨在为桂花残渣总黄酮在饲料工业中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器 桂花残渣，粉碎后恒温干燥备用；芦丁（中国药品生物制品检验所，纯度≥98%）；纤维素酶（15000 U/g，国药集团化学试剂有限公司）；乙醇、NaNO2、Al（NO）3、醋酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、抗坏血酸、2，2-二苯代苦味酰基苯肼基（DPPH）等均为分析纯。

GR-200电子天平 （日本 AND）、pHS-3TC（0.01级）精密酸度计（上海天达仪器有限公司）、WF-2000微波快速反应系统（上海屹尧分析仪器有限公司）、DHG-9075A型电热鼓风箱（上海一恒科技有限公司）、Cary50型紫外可见分光光度计（美国瓦里安）、80-1型离心机 （江苏金坛正基仪器有限公司）、FW117中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）、SHZ-D9（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制 采用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定总黄酮含量（王桃云等，2009）。精密称取0.010 g在60℃烘干至恒重的芦丁标准品，置100 mL的容量瓶中，用体积分数为60%的乙醇定容，配制浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准液，精密量取芦丁标准溶液 0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分别移入7个25 mL的容量瓶中，先加入0.3 mL质量分数为5%的NaNO2，摇匀，静置6 min，再加入 0.3 mL 质量分数为 10%的 Al（NO3）3，静置6 min，待溶液充分络合，颜色不再变化后加入4 mL质量分数为4%的NaOH，最后用体积分数为60%的乙醇定容至刻度线，在510 nm处测定吸光度，分别以芦丁标准溶液及测定的吸光度为横纵坐标绘制标准曲线，回归方程为：

A=15.05C+0.0114，R2=0.9984；

式中：A为吸光度值；C为芦丁标准溶液，mg/mL。

1.2.2 桂花残渣总黄酮的提取 称取备用的桂花残渣粉末1.000 g，倒入50 mL锥形瓶中，加入60%体积分数的乙醇，移入微波反应系统，根据设定的参数进行微波预处理后再加入缓冲液调节pH，在恒温水浴槽中进行酶解。酶解完成后得到的提取液经过抽滤、离心，取上清液作为提取液的最终测定样本测定桂花残渣总黄酮吸光度，计算提取率。

将测定的桂花残渣总黄酮的吸光度回代入标准曲线方程中求出对应的浓度C，按下式计算提取率。

桂花残渣总黄酮提取率/（mg/g）=VCX/W；

式中：V为测定液的体积；C为桂花残渣总黄酮测定样品液浓度；X为桂花残渣总黄酮提取液稀释总倍数；W为每次提取加入的桂花残渣质量，g。

1.3 桂花残渣总黄酮的抗氧化活性试验

1.3.1 清除羟自由基活性研究 参照陈佳等（2011）和孟娜（2014）的方法，将微波预处理酶法最佳工艺条件下提取的桂花残渣总黄酮提取液配制成不同质量浓度梯度的溶液8份，相同质量浓度的抗坏血酸作为对比，每个质量浓度的提取液均取2.00 mL移入25 mL的容量瓶中，依次加入6.0 mmol/L的硫酸亚铁 2.0 mL，1.0 mmol/L的双氧水2.0 mL混合均匀，静置10 min后再加入6.0 mmol/L的水杨酸2.0 mL，反应30 min于510 nm处测定吸光度，记为A0；用双氧水代替水杨酸测得的吸光度记为A1；以蒸馏水代替提取液所测得的吸光度记为A2。每次试验重复三次，以其平均值作为最终的试验值，按下式计算清除率：

羟自由基清除率/%=[1-（A0-A1）/A2]×100。

1.3.2 清除DPPH自由基活性研究 参照孟娜等（2014）和丁振柱（2011）的方法，将微波预处理酶法最佳工艺条件下提取的桂花残渣总黄酮提取液配制成不同质量浓度梯度的溶液8份，每个质量浓度的溶液均取2.0 mL移入10 mL的具塞试管中，再加入2.0 mL浓度为0.06 mg/mL的DPPH自由基溶液（用60%体积分数的乙醇溶解0.06 mg的DPPH自由基，转移到100 mL棕色的容量瓶中定容），混合均匀后反应30 min，于4000 r/min离心10 min，取上清液在波长517 nm处测定吸光度，记为A0；另移取2.0 mL不同质量浓度的总黄酮溶液于10 mL的具塞试管中，分别加入无水乙醇2.0 mL，在波长517 nm处测定其吸光度，记为A1；以2.0 mL 0.03 mg/mL的DPPH自由基溶液和2.0 mL无水乙醇反应作为参比测定吸光度，记为A2；以抗坏血酸作为对照。每个试验平行测定三次，取平均值作为最终试验数据。按下式计算清除率：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A0-A1）/A2]×100。

1.4 正交试验因素与水平 基于单因素试验结果，选取试验所涉及的5个单因素作为影响因子，桂花残渣总黄酮提取率为响应值，设计正交试验进一步考察酶法提取桂花残渣总黄酮中酶解时间、纤维素酶用量、料液比、pH及酶解温度对桂花残渣总黄酮提取率的影响，并优化筛选出最佳提取工艺参数，正交试验设计因素与水平见表1。

表1 正交试验设计因素与水平

2 试验结果与分析

2.1 微波预处理对酶法提取桂花残渣总黄酮的影响 称取1 g桂花残渣粉末放入50 mL的锥形瓶中，加入25 mL体积分数为60%的乙醇，转入微波反应系统中预处理1 min，微波温度50℃，微波功率300 W。预处理后移出，加入纤维素酶8 mg，调节pH=6，在50℃条件下酶解。桂花残渣总黄酮提取率在微波预处理和未经微波预处理情况下随酶解时间延长的变化结果如图1所示。

图1 微波预处理对桂花残渣总黄酮提取效果的影响

由图1可以看出，与未经微波预处理组相比，微波预处理组不仅提取率高而且缩短了提取时间。微波预处理组酶解40 min的提取率和未经预处理组酶解90 min的提取效果基本相当，微波预处理组酶解60 min时提取率最高达到25.19 mg/g，而未经微波预处理酶解60 min提取率仅为17.33 mg/g。微波辐射能加快分子热运动，细胞内的压强不断增大最终破坏细胞壁，再经过充分酶解，桂花残渣中的总黄酮更易溶出而被提取出来。微波预处理对酶解过程具有一定的协同及促进作用。

2.2 单因素试验结果及分析

2.2.1 纤维素酶用量对桂花残渣总黄酮提取率的影响 称取1 g桂花残渣粉末放入50 mL的锥形瓶中，加入25 mL的体积分数为60%的乙醇，添加不同量的纤维素酶，用缓冲液调节pH=6，在50℃条件下酶解60 min，考察纤维素酶用量对桂花残渣总黄酮提取量的影响，结果如图2所示。

图2 纤维素酶用量对桂花残渣总黄酮提取率的影响

纤维素酶能破坏桂花残渣的细胞壁，有助于总黄酮的溶出。由图2可知，纤维素酶用量在10 mg时桂花残渣中总黄酮的提取率最大，这主要是因为纤维素酶添加量较少，桂花残渣的细胞壁破坏不完全，黄酮不能全部释放出来；纤维素酶添加量较多进一步促进了破壁效果，各种醇溶性杂质竞相溶出，但同时也容易和桂花残渣中的多糖类物质黏附，堵塞总黄酮的部分溶出通道，因此提取率减小，故10 mg纤维素酶的效果最好。

2.2.2 料液比对桂花残渣总黄酮提取率的影响 称取1 g桂花残渣粉末放入50 mL锥形瓶中，配制成不同的料液比，添加8 mg纤维素酶，用缓冲液调节pH=6，在50℃条件下酶解60 min，考察料液比对桂花残渣总黄酮含量的影响，结果如图3所示。

图3 料液比对桂花残渣总黄酮提取率的影响

由图3可知，并不是料液比越大提取率越高。料液比在1∶35 g/mL时桂花残渣总黄酮的提取率最大，料液比小，一方面传质速率小，另一方面酶在提取剂中分散空间有限容易黏结，活性受到影响，因此提取效果不好；料液比增大溶剂消耗量大且提取率增幅不明显，对于优化工艺来说没有太大意义，1∶25～1∶35 g/mL 桂花残渣的提取率比较接近，综合考虑提取成本及提取率，选择1∶25g/mL为最佳料液比。

2.2.3 pH对桂花残渣总黄酮提取率的影响 称取1 g桂花残渣粉末放入50 mL的锥形瓶中，加入25 mL体积分数为60%的乙醇，添加8 mg纤维素酶，用缓冲液调节为不同的pH，在50℃条件下酶解60 min，考察pH对桂花残渣总黄酮含量的影响，结果如图4所示。

图4 pH对桂花残渣总黄酮提取率的影响

纤维素酶的活性高对应的桂花残渣总黄酮提取率就高，pH是影响纤维素酶活性的重要因素。由图4可知，弱酸环境对纤维素酶活性的影响非常明显，桂花残渣总黄酮在pH=6时提取率最高，偏碱性的环境中纤维素酶容易失活，总黄酮的提取效果不好，因此，提取时选择pH=6较好。

2.2.4 酶解温度对桂花残渣总黄酮提取率的影响称取1 g桂花残渣粉末放入50 mL的锥形瓶中，加入25 mL的体积分数为60%的乙醇，添加8 mg纤维素酶，用缓冲液调节pH=6，在不同温度条件下酶解60 min，考察酶解温度对桂花残渣总黄酮含量的影响，结果如图5所示。

图5 酶解温度对桂花残渣总黄酮提取率的影响

温度是酶解过程中一个重要的影响因素，酶在适宜的温度下才会有效地进行酶解反应。由图5可知，桂花残渣总黄酮提取率随酶解温度的升高先增大后减小，60℃时提取率最高。低温不足以激发纤维素酶的活性，高温又容易使纤维素酶失活而且能耗高，因此选择60℃作为较佳的酶解温度。

2.3 正交试验结果及分析 以酶解时间、纤维素酶用量、料液比、pH、酶解温度为正交试验的5个影响因子，桂花残渣总黄酮提取率为指标，通过L16（45）正交试验优化酶法提取桂花残渣总黄酮的提取工艺。 结果如表1所示。

表1 正交试验结果

由表1可知，pH对酶法提取桂花残渣总黄酮影响最大，其余依次为酶解温度、酶解时间、纤维素酶用量及料液比。pH和酶解温度影响纤维素酶的活性，直接决定桂花残渣总黄酮的提取，因此在试验过程中要严格控制，合理调节。正交试验优化的最佳工艺参数为：酶解70 min，纤维素酶用量8 mg，料液比 1∶30 g/mL，pH=6，酶解温度 60 ℃。由于正交试验中无此组合，因此要对其进行验证。在优化的试验条件下进行三次平行试验，所得提取率分别为 26.416、26.183、26.274 mg/g， 效果优于其他组合的提取率，故取其平均值26.291 mg/g为正交优化条件下的最终提取率。

2.4 桂花残渣总黄酮提取液性质研究

2.4.1 抗氧化活性研究

2.4.1.1 清除羟自由基活性 由图6可知，总黄酮和抗坏血酸对羟自由基的清除效果均与质量浓度呈正比关系，总体来看，桂花残渣总黄酮提取液清除羟自由基能力不及抗坏血酸，高浓度时的桂花残渣总黄酮提取液对羟自由基的清除能力接近抗坏血酸，具有较好的抗氧化活性。桂花残渣总黄酮提取液质量浓度为0.06 mg/mL时清除羟自由基能力大于抗坏血酸，低浓度的桂花残渣总黄酮提取液清除羟自由基能力与抗坏血酸相比没有优势。

图6 羟自由基清除试验结果

2.4.1.2 清除DPPH自由基活性 由图7可知，浓度在0.04～0.06 mg/mL，桂花残渣总黄酮提取液清除DPPH自由基能力强于抗坏血酸。低浓度范围内，随着总黄酮提取液质量浓度的增大，DPPH自由基的清除率增长较快，浓度大于0.14 mg/mL之后清除率基本不变，而大于此浓度的抗坏血酸的清除率依然继续增大，最大清除率达到91.016%，桂花残渣总黄酮提取液对DPPH的最大清除率为77.472%。虽然桂花残渣总黄酮提取液清除DPPH自由基能力整体没有抗坏血酸好，但还是具有一定的清除DPPH自由基能力。

3 结论

图7 DPPH自由基清除试验结果

3.1 微波预处理能缩短酶法提取桂花残渣总黄酮的提取时间，同时提取率也得到大幅度的提升。正交试验优化的最佳工艺参数为：酶解时间70 min，纤维素酶用量 8 mg，料液比 1∶30 g/mL，pH=6，酶解温度60℃，此条件下的提取率为26.291 mg/g。

3.2 桂花残渣总黄酮提取液对DPPH自由基和羟自由基均有很强的清除能力，作为饲料抗氧化剂能减少因自由基引发疾病的发病率，提高禽畜机体免疫力.

注：因版面所限参考文献省略，如有需要，可来函索取。电子邮箱：iamliujunhai@126.com