阿托伐他汀对兔动脉粥样硬化斑块稳定性及斑块内血管新生的影响

曹桂秋　刘立志　王贵鹏宣晓岗李玲玲(新疆医科大学第五附属医院老年病科，新疆　乌鲁木齐　8300)



阿托伐他汀对兔动脉粥样硬化斑块稳定性及斑块内血管新生的影响

曹桂秋刘立志王贵鹏1宣晓岗1李玲玲2
(新疆医科大学第五附属医院老年病科，新疆乌鲁木齐830011)

〔摘要〕目的探讨阿托伐他汀对兔动脉粥样硬化(AS)斑块稳定性及斑块内血管新生的影响。方法将80只新西兰大白兔按随机数字表法随机分为无药物干预常规超声造影组(A组)，无药物干预超声微泡造影组(B组)，阿托伐他汀干预超声常规造影组(C组)，阿托伐他汀干预超声微泡造影组(D组)，每组20只;建立AS模型后，利用免疫组化法检测斑块组织血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞分化抗原40配体(CD40L)，第8因子相关抗原(FVⅢRAg)及基质金属蛋白酶(MMP)-3的蛋白表达;利用超声造影技术对斑块进行常规超声及微泡造影检查，并采用ACQ分析软件得到斑块的始增时间(AT)、到达时间(TTP)、峰值时间(PI)以及基础强度(BI)，计算增强强度(EI);利用病理组织学检查以及抗CD34免疫组化染色法，算出微血管密度(MVD)，并与造影参数进行相关性分析。结果所有模型高脂喂养后，相对于A组+B组，C组+D组的内皮细胞肿胀、变性减轻，且脂质沉积和泡沫细胞也减少;同时C组+D组AS斑块内VEGF，FVⅢRAg，MMP-3和CD40L的阳性染色面积以及MVB值也均明显低于A组+B 组(均P＜0. 01);另外D组AS斑块EI值与MVD值呈正相关(r=0. 665，P＜0. 01)，高于C组AS的EI值与MVD值相关性(r=0. 401，P＜0. 01)。结论阿托伐他汀具有稳定AS斑块的作用，抑制斑块内血管新生可能为其机制之一，而超声微泡造影剂有助于评价AS斑块新生血管情况。

〔关键词〕阿托伐他汀;动脉粥样硬化;超声造影;微泡;斑块

1新疆医科大学第五附属医院心内科

2新疆医科大学第五附属医院超声科

第一作者:曹桂秋(1972-)，女，博士，主任医师，主要从事心血管疾病诊治方面的研究。

动脉粥样硬化(AS)是引发急性冠脉综合发生的主要机制〔1〕。有研究发现，AS斑块内有出现的病理性新生血管，它可能有助于促进粥样硬化的发展，甚至导致斑块破裂或斑块内出血〔2〕。阿托伐他汀对AS斑块具有稳定的作用，同时发现其能影响斑块内血管新生〔3〕，但相关报道较少。而超声造影剂作为血池显影剂可以定量评价斑块内新生血管数量以及斑块稳定性。本研究通过使用高脂饮食及球囊导管血管损伤术制作兔腹主动脉AS斑块模型，并利用超声造影技术及免疫组化法进行定量分析，旨在探讨阿托伐他汀对AS模型斑块的稳定性以及其对斑块内新生血管的影响。

1　资料与方法

1. 1一般资料健康新西兰兔80只，体重2. 0～2. 5 kg，由温州医学院动物实验中心提供，将其随机分为无药物干预常规超声造影组(A)、无药物干预超声微泡造影组(B)、阿托伐他汀干预超声常规造影组(C)、阿托伐他汀干预超声微泡造影组(D)，各20只;高脂饲料由上海斯莱克实验动物有限公司提供(含1. 5%胆固醇);阿托伐他汀由杭州默沙东制药有限公司提供(批号: 07455);免疫组化一抗工作液由北京博奥森公司提供; BX51光学显微镜(日本，Olympus公司); GE LOGIQ9超声诊断仪(美国，GE公司)。

1. 2建立兔腹主AS斑块模型所有实验兔进行适应性喂养1 w后，均给予高脂饲料100 g/d，自由进食摄水，喂养2 w后进行腹主动脉球囊导管血管损伤术:耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后，取右股动脉搏动最强处钝性分离及穿刺，将2. 5 mm×15 mm的球囊导管送入腹主动脉处，推注7～8个标准大气压充盈球囊反复回拉造成动脉内膜损伤，并将结扎伤口逐层进行逢合。术后肌肉注射8万单位的庆大霉素以预防感染。C组及D组在造模后在高脂饲料中拌入阿托伐他汀5 mg·kg-1·d-1，继续喂养6 w。

1. 3超声检查使用GE Logiq 9超声诊断仪，9 L探头，频率8 MHz。剑下扫查，待腹主动脉图像稳定后，B组及D组经兔耳缘静脉弹丸式注入超声微泡造影剂(声诺维)，按0. 02 ml/kg剂量;而A组及C组再注入SonoVue造影剂0. 1 ml后，启动contrast条件开始同步计时，观察斑块增强特征，对过程进行图像动态存储，在脱机状态下利用声学定量分析软件(ACQ)对图像进行分析。记录兔腹主动脉斑块超声造影感兴趣区(ROI)，并使用时间-强度曲线(TIC)将兔腹主动脉斑块的到达时间(AT)、达峰时间(TTP)、峰值强度(PI)以及斑块的基础强度(BI)进行记录，计算增强强度(EI，EI=PI－BI)，并将EI值与免疫组织化学量化结果做相关性分析。

1. 4免疫组化检测微血管密度(MVD)测定:所有实验兔模型检查后立刻处死，用10%甲醛固定目标斑块标本，常规脱水，石蜡包埋，制备成4 μm厚连续切片，并进行苏木素-伊红(HE)染色，观察动脉斑块形态学表现。病理检查后，用抗CD34单克隆抗体标记血管中层、斑块基底部及纤维帽与斑块肩部的内皮细胞，然后在200倍显微镜视野下计数每一视野的微血管数。MVD的测定方法: CD34阳性标准为血管内皮细胞呈棕褐色或棕黄色染色，将染成棕褐色的内皮细胞簇或单个内皮细胞视为1个血管计数，结构只要不相连，其分支结构也视为1个血管计数。微血管计数方法:首先在低倍镜(40倍)下对切片进行观察，找到3个血管染色最密集的地方，然后在高倍镜(200倍)下对这3个视野分别进行微血管计数，取平均值作为该切片的MVD值。

AS斑块内血管内皮生长因子(VEGF)、第8因子相关抗原(FVⅢRAg)，基质金属蛋白酶(MMP)-3及白细胞分化抗原40配体(CD40L)的蛋白测定: 60℃条件下静置切片1 h，使用二甲苯以及梯度乙醇进行脱蜡处理，使用5%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶15 min。4℃条件下采用一抗孵育过夜，再采用二抗结合30 min，并用二氨基联苯胺(DAB)显色以及HE复染，脱水后用中性树胶进行封片。DAB显色为棕黄色颗粒状表示阳性结果，而斑块内VEGF、FVⅢRAg、MMP-3以及CD40L阳性的区域面积占整个斑块面积的比例可利用IPP软件得到。

1. 5统计学方法应用SPSS17. 0软件进行分析t检验、Person相关分析。

2　结果

2. 1一般情况在球囊导管血管损伤术操作过程中有4只兔死亡，而术后3只兔发生感染死亡，3只兔因饲料没有食用完而退出实验，其余70只兔均完成实验，最终A、B、C、D组纳入分析的实验兔分别为18、17、18、17只。

2. 2病理形态学改变所有模型高脂喂养后，HE染色显示A 组+B组腹主动脉内有明显的AS斑块形成，内膜增厚明显且含有大量泡沫细胞，并形成了纤维帽，斑块内可见胆固醇结晶，而进行C组+D组内皮细胞肿胀、变性减轻，且脂质沉积和泡沫细胞也减少。

2. 3各组免疫组化结果改变所有模型的AS斑块内均发现很多棕黄色颗粒，且明显聚集于斑块肩部及基底部，而C组+D组棕黄色颗粒比A组+B组少。同时C组+D组AS斑块内VEGF、FVⅢRAg、MMP-3和CD40L的阳性染色面积均比A组+ B组明显减少(均P＜0. 01)。另外C组+D组MVB值明显低于A组+B组(P＜0. 01)。见表1。

表1　各组斑块组织免疫组化指标比较(x ±s，n=35)

2. 4斑块超声分子显像EI与免疫组化法测定的MVD结果相关性分析8 w后，D组AS斑块EI值与MVD值呈线性正相关(r= 0. 665，P＜0. 05)，而PI、AT、TTP值与MVD值均无相关性(r=0. 259，0. 088，－0. 112，均P＞0. 05); C组AS斑块EI值与MVD值也呈线性正相关(r = 0. 401，P＜0. 01)，但相关性低于D组。

3　讨论

AS是影响人类健康的主要疾病，绝大多数患者无任何前驱表现，常死于急性心血管事件。研究显示，AS斑块破裂和血栓形成是导致急性心血管病事件的主要原因，而斑块的易损性及不稳定斑块破裂是导致急性冠状动脉综合征的重要因素之一，及时判断AS程度已成为预防事件发生的重点〔4〕。另外有研究显示斑块内大量新生血管的出现与斑块的不稳定性密切相关〔5〕。他汀类药物在降低冠心病的发病率和死亡率方面的意义非常大，其不仅能降低低密度脂蛋白胆固醇，还具有不依赖于降脂作用的心血管保护效应，如稳定易损斑块、改善内皮功能、抗感染、抗氧化、免疫调节、降压、抑制血栓形成等〔6〕。研究表明阿托伐他汀在抗AS的形成及发展方面具有非常重要的作用〔7〕。

MMPs是一组可消化细胞外基质的重要酶类，能降解纤维帽成分造成结构破坏，从而有助于促进斑块破裂，是造成AS斑块不稳定的主要原因〔8〕。而CD40L可表达于AS斑块的内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的表面，能够诱导内皮细胞、单核/巨噬细胞及血管平滑肌细胞表达MMPs〔9〕。本研究结果提示阿托伐他汀具有抑制斑块内CD40L的表达，进而降低MMP-3的表达，从而减少斑块局部的基质降解，有助于保持斑块的稳定性。而VEGF是一种生长因子，对血管内皮细胞的有丝分裂具有促进作用，研究证实其能明显表达于在AS斑块中，对斑块的发生与发展可能有促进作用〔10〕。而FVⅢRAg是一种糖蛋白，可在内皮细胞表面广泛表达，一般存在于小的毛细血管或毛细血管尚未形成管腔的分支，是新生血管内皮的特异性标志物〔11〕。VEGF和FVⅢRAg在血管形成过程起着非常重要的作用。本研究结果说明阿托伐他汀可一定程度抑制VEGF和FVⅢRAg在实验兔AS斑块模型中的表达，同时能降低斑块内MVB值。另外病理形态观察结果显示，在高脂饮食的情况下，进行阿托伐他汀干预的模型其内膜内皮细胞肿胀、变性较未进行阿托伐他汀干预的模型减轻，且脂质沉积和泡沫细胞也减少，表明阿托伐他汀有助于改善内皮细胞功能，对AS斑块的控制具有一定作用。

超声造影可用来直观AS斑块内微血管分布情况，可用来评价AS斑块稳定程度，超声微泡造影剂是一种新型超声造影剂，相对于常规造影剂具有更好的显影效果。蛋白质、糖类、脂质等生物成分构成其外壳，而内部使用空气或者惰性气体进行填充，在人体注入后，周围血液与微泡内气体形成的界面可最大程度地将入射超声(＞99%)反射回来，从而增强超声反射信号的强度〔12〕。因为微泡的反射信号为非线性回声，通过选择性接收微泡的非线性回声或抵消组织内的线性回声，可使超声显像的对比度和分辨率明显增强。本研究说明超声微泡造影剂相对于常规超声造影剂更有助于定量评价斑块的增强情况，从而更有利于定量评价AS斑块新生血管密度。

综上所述，阿托伐他汀抑制斑块内血管的新生可能是其稳定AS斑块的机制之一。另外超声微泡造影可定量测量斑块EI，其与MVD具有良好相关性，可用于定量评价斑块内MVD。

4参考文献

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3蔡敏，马璟曦，罗春阳，等.阿托伐他汀对急性脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块的影响〔J〕．重庆医学，2012; 41(7): 656-7，660.

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11李丹，李玉洁，杨庆，等.血管内皮功能障碍与动脉粥样硬化研究进展〔J〕．中国实验方剂学杂志，2012; 18(8): 272-6.

12刘兴钊，任建丽，王志刚，等.超声微泡造影剂在冠状动脉粥样硬化性心脏病治疗中的应用进展〔J〕．临床超声医学杂志，2012; 14(7): 471-3.

〔2015-02-16修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(No．2014211C124)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5717-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 015

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R743