电针对自发性胰岛素抵抗大鼠血清SOD、MDA及eNOS表达的影响

蓝丹纯　易　玮　许能贵　孙　健(广州中医药大学，广东　广州　50405)



电针对自发性胰岛素抵抗大鼠血清SOD、MDA及eNOS表达的影响

蓝丹纯易玮许能贵孙健1(广州中医药大学，广东广州510405)

〔摘要〕目的探讨电针对胰岛素抵抗大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及主动脉一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达的影响。方法以8只雄性LETO大鼠作为Blank组，将16只雄性OLETF大鼠随机分为E-A组及Model组，每组8只。Blank组及Model组进行正常饲养，不给予其他处理。E-A组针刺双侧内关、三阴交、足三里及肾俞，并予双侧足三里及三阴交加电。每日1次，每次20 min，持续4 w。治疗结束后，禁食12 h，次晨眼眶静脉窦采血。检测各组大鼠空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素敏感性指数(ISI)、SOD、MDA、一氧化氮(NO)及内皮素(ET)-1。HE染色观察主动脉病理变化，Western印迹分析主动脉eNOS的蛋白表达。结果Model组的FPG、FINS、MDA、ET相比Blank组显著升高(P=0. 001，P=0. 032，P=0. 000，P=0. 037)，ISI、SOD、NO较Blank组显著降低(P=0. 001，P=0. 000，P= 0. 018)。E-A组的FPG、FINS、MDA较Model组显著降低(P=0. 007，P=0. 001，P=0. 000)，ISI、NO相比Model组显著升高(P=0. 000，P= 0. 016)，ET-1水平虽无统计学意义(P＞0. 05)，但有所降低。光镜显示，电针干预对总体病理损伤有不同程度的改善。E-A组eNOS蛋白表达明显高于Model组(P=0. 005)。结论电针干预对胰岛素抵抗及氧化应激状态有良性调节作用，有助于抗氧化、抗血管损伤，促进内皮功能障碍的改善。

〔关键词〕电针;胰岛素抵抗;内皮功能障碍;氧化应激

1广东省中医院

第一作者:蓝丹纯(1988-)，女，在读博士，主要从事针灸治病机制研究。

胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病的特征之一，在出现临床高血糖前就已经存在〔1〕。血管内皮不仅是胰岛素由血液进入靶组织的必经之路，也是胰岛素的非经典靶组织、糖尿病血管病变的关键靶组织〔2〕。研究表明，IR和血管内皮功能障碍之间相互影响，参与糖尿病大血管和微血管并发症的发生与发展，与动脉粥样硬化、高血压等心脑血管疾病密切相关〔3～5〕。不论是改善IR，还是调节血管内皮功能，针灸疗法已经得到良好的疗效验证〔6，7〕。本研究采用自发性IR模型(OLETF)大鼠进行针刺干预治疗，通过观察超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，及反映血管舒缩功能的一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)及NO合成酶(eNOS)水平的变化，探讨针刺对IR及血管功能改善的作用机制。

1　材料与方法

1. 1实验动物选用16周龄SPF级雄性OLETF大鼠16只(体重450～500 g)，LETO大鼠8只(体重400～425 g)，由Otsuka制药公司在滨松(日本)的研究实验室提供，合格证号: 99005800000055，使用许可证号: SYXK(粤)2013-0001。饲养及实验过程均于广州中医药大学实验动物中心SPF级环境内。统一的饲料配方(质量比):玉米31%，小麦18%，豆粕21%，稻谷4%，黄豆2%，麸皮10%，蛋黄粉3%，鱼粉6%，预混料3. 5%，植物油1. 5%，多种维生素1%，由实验动物中心提供。整个实验过程符合实验室动物护理和使用的伦理指导原则。

1. 2主要试剂及仪器SOD、MDA及NO测定试剂盒均购自南京建成公司;胰岛素(FINS)测定试剂盒购自默科迪亚公司; ET-1测定试剂盒购自Assay Designs公司;抗eNOS抗体购自艾博抗公司;荧光数码成像显微镜(型号: BX51T+DP72+IPP，日本奥林巴斯公司)，G6805-2A型低频电子脉冲治疗仪(YZB/沪0735-26-2009，上海华谊医用仪器有限公司)，一次性无菌针灸针(华佗牌，规格: 0. 35 mm×13 mm)。

1. 3穴位定位(1)肾俞位于大鼠后背第二腰推下旁开5 mm;(2)足三里位于大鼠后肢膝关节外下方当腓骨小头下约5 mm;(3)三阴交位于大鼠后肢内踝尖直上10 mm;(4)内关位于前肢内侧，离腕关节约3 mm左右的尺桡骨缝间。

1. 4实验分组LETO大鼠8只，为空白(Blank)组，OLETF大鼠随机分为模型(Model)组、电针(E-A)组，每组8只。Blank组和Model组不予针刺。E-A组予以针刺干预，双侧足三里及三阴交给予电针刺激，疏密波(疏波2 Hz，密波50 Hz，调制频率10次/min)，强度以大鼠后肢轻微抖动为度，20 min/次，1次/d，持续治疗4 w。

1. 5标本采集及检测针刺疗程结束后禁食不禁水12 h，次晨麻醉，眼眶静脉窦采血。空腹血糖(FPG)测定用葡萄糖氧化酶法; FINS、ET-1测定采用ELISA法，严格按说明书进行操作; SOD、MDA及NO分别采用WST-1法、TBA法及硝酸还原酶法测定。ISI参照李光伟〔8〕的方法: ISI= 1/(FPG×FINS)，因其为偏态分布，故取自然对数比较。10%水合氯醛麻醉，截取主动脉3 mm×2 mm大小置于4%多聚甲醛固定，备HE染色光镜观察，余下主动脉置于－20℃保存，用于Western印迹检测。

1. 6统计学方法采用SPSS19. 0软件，采用单因素方差分析，方差齐性用LSD比较，方差不齐用Tamhane比较。

2　结果

2. 1电针对OLETF大鼠血清FPG、FINS、ISI的影响Model组的FPG、FINS相比Blank组显著升高(P= 0. 001，P= 0. 032)，ISI较Blank组显著降低(P = 0. 001)。E-A组的FPG、FINS较Model组显著降低(P= 0. 007，P= 0. 001)，ISI比Model组显著升高(P=0. 000)。见表1。

表1　各组大鼠血清FPG、FINS、ISI的影响(x ±s，n=8)

2. 2电针对OLETF大鼠血清SOD、MDA的影响Model组的SOD水平比Blank组显著降低(P=0. 000)，MDA显著升高(P= 0. 000)。相比Blank组，E-A组的SOD水平显著降低(P = 0. 000)，MDA升高(P = 0. 021)。E-A组SOD水平相比Model组显著升高(P=0. 005)，MDA显著降低(P=0. 000)。见表2。

2. 3电针对OLETF大鼠血清NO及ET-1的影响Model组血清NO水平相比Blank组减低(P = 0. 018)，而ET-1水平升高(P=0. 037)。与Model组相比，NO水平升高(P= 0. 016)，ET-1水平虽无统计学意义(P＞0. 05)，但略降低。见表2。

表2　各组大鼠血清SOD、MDA、NO、ET-1的比较(x ±s，n=8)

2. 4电针对OLETF大鼠主动脉形态学的影响Blank组主动脉内膜光滑完整连续，无增厚缺损，内皮下连接紧密，血管平滑肌细胞排列整齐。而Model组血管内膜增厚，部分连接开大、水肿，弹力纤维断裂，部分平滑肌细胞增生肥大、排列紊乱。EA组的主动脉内膜层尚完整，无明显增厚，弹力纤维层、平滑肌层未见明显紊乱，总体病理损伤有不同程度的改善。见图1。

2. 5电针对OLETF大鼠主动脉eNOS蛋白表达的影响Model组(0. 36±0. 06)相比空白组(0. 48±0. 01)，eNOS蛋白表达明显减少(P=0. 000)，E-A组(0. 58±0. 03)相比Blank组蛋白表达减少(P = 0. 011)，与Model组相比蛋白表达显著增加(P = 0. 005)。见图2。

图1　电针对各组大鼠主动脉形态学的影响(HE染色，×200)

图2　电针对各组大鼠主动脉eNOS蛋白表达的影响

3　讨论

研究表明，糖脂代谢紊乱引起的氧化应激与IR、血管内皮功能障碍密切相关。在正常情况下，机体内产生的少量氧自由基能够被体内抗氧化酶如SOD迅速消除，保护机体免受损伤。氧化应激状态下，活性氧产物生成增加，过剩的氧自由基可引起脂质过氧化反应，生成脂质过氧化物MDA〔9〕。而脂质毒性又可增加脂肪组织的氧化应激，影响线粒体功能，促进IR，介导内皮细胞损伤，以此形成恶性循环。SOD活力间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA含量又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。本研究结果显示，模型组的SOD活性相比空白组明显降低，MDA含量明显升高，经电针干预，电针组的SOD活性、MDA含量、IR相比模型组均得到良性调整。

NO可直接作用于血管平滑肌而舒张血管，发挥调节血压、抑制白细胞和血小板聚集、抗血管增殖等作用。ET-1可长效缩血管、促进血小板、单核巨噬细胞的聚集黏附。当内皮功能障碍时，其为损伤标记物〔10〕。因此NO与ET-1的平衡与否影响着血管的正常舒缩功能。氧化应激状态下，活性氧的增加是抑制eNOS活性，造成eNOS解偶联的根本原因。eNOS解偶联一方面使得NO生成减少，生物利用率降低，另一方面又可加重氧化应激状态。本研究结果显示，电针干预后的OLETF大鼠血清NO明显升高，主动脉eNOS蛋白表达增加，ET-1降低，主动脉总体病理损伤亦有不同程度的改善。

2型糖尿病可归属于“消渴”范畴，其主要病机是“本虚标实”，具体表现为“脾肾两虚，痰瘀阻络”。本课题以“健脾益肾、活血化痰”治法，穴选补益肾气，通阳利水之功的“肾俞”，益气健脾、和胃化痰之效的“足三里”，健脾、疏肝、益肾的“三阴交”和理气活血的“内关”。诸穴共用，以期共奏“健脾益肾、活血化痰”之效。本研究表明，通过针灸的干预早期控制氧化应激状态，可改善IR状态、改善调整血管内皮功能、预防血管病变，对临床治疗糖尿病有重要的指导作用。

4参考文献

1廖二元.内分泌代谢病学〔M〕．第3版.北京:人民卫生出版社，2012: 1220.

2 Steinberg HO，Chaker H，Lcaming R，et al．Obesity/insulin resistance is associated with endothelial dysfunction. Implications for the syndrome of insulin resistance〔J〕．J Clin Invest，1996; 97(11): 2601-10.

3 Gonzalez MA，Selwyn AP. Endothelial function，inflammation，and prognosis in cardiovascular disease〔J〕．Am J Med，2003; 115(8): 99-106.

4龙盼，张俊峰.血管内皮功能障碍与动脉粥样硬化〔J〕．国际心血管病杂志，2011; 38(2): 79-81.

5赵良平，吕安康，张奇.胰岛素抵抗与血管内皮功能障碍〔J〕．国际心血管病杂志，2009; 36(1): 14-7.

6王媛，刘志诚，徐斌.针刺治疗女性2型糖尿病疗效分析〔J〕．中国针灸，2014; 34(1): 21-4.

7卫彦，寇吉友，陈军.针刺人迎穴对高血压患者血清中血管活性物质影响的研究〔J〕．针灸临床杂志，2010; 26(2): 12-4.

8李光伟．胰岛素敏感性评估及其在临床研究中的应用〔J〕．中华内分泌代谢杂志，2000; 16(3): 198-200．

9 Bandeira Sde M，Guedes Gda S，da Fonseca LJ，et al. Characterization of blood oxidative stress in type 2 diabetes mellitus patients: increase in lipid peroxidation and SOD activity〔J〕．Oxid Med Cell Longev，2012: 819310.

10李定祥，方学杰，刘晓丹，等.急性脑梗死中医证型与血清ET-1、vWF、H-FABP、PAO的相关性研究〔J〕．中国中医基础医学杂志，2014; 20(8): 1092-3.

（2014-12-22修回）
（编辑袁左鸣）

Effect of electroacupuncture on serum levels of SOD，MDA and expression of eNOS of thoracic in OLETF rats

LAN Dan-Chun，YI Wei，XU Neng-Gui，et al．
Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，Guangdong，China

【Abstract】Objective To investigate the effect of electroacupuncture(E-A)on the serum levels of superoxide dismutase(SOD)，malondialdehyde(MDA)and the expression of endothelial nitric oxide synthase(eNOS)of thoracic in OLETF rats．Methods Sixteen male OLETF rats were randomly divided into E-A and model groups，eight rats in each group．Eight male LETO rats were divided as blank group．The E-A group was applied to bilateral Neiguan(PC6)，Zusanli(ST36)，Sanyinjiao(SP6)，and Shenshu(BL23)．Needles in Zusanli(ST36)，Sanyinjiao(SP6)were connected with E-A．At the end of the experiment，glucose oxidase method，ELISA，WST-1，TBA and nitric acid deoxidize enzyme methods were used to detect the levels of fasting blood glucose(FPG)，serum insulin(FINS)，insulin sensitivity index(ISI)，ET-1，SOD，MDA and NO．The aortic pathology was observed by HE staining．The expression of eNOS was detected by Western blot．Results Compared with those of blank group，serum levels of FPG，FINS，MDA and ET-1 in model group were significantly increased(P = 0．001，P=0．032，P=0．000，P=0．037)，but the levels of ISI，SOD and NO were obviously decreased(P= 0．001，P= 0．000，P= 0．018)．Compared with those of model group，serum levels of FPG，FINS and MDA in E-A group were greatly decreased(P= 0．007，P= 0．001，P= 0．000)，the levels of ISI and NO were significantly increased(P=0．000，P=0．016)．The level of ET-1 in E-A group was lower than that of model group even though it was no statistical significance(P＞0．05)．E-A improved morphological changes of thoracic．The expression of eNOS in E-A group was significantly higher than that of model group(P=0．005)．Conclusions E-A intervention on insulin resistance and oxidative stress state has a positive adjustment which regulates oxidation resistance，prevents blood vessel damage and promotes the improvement of endothelial dysfunction．

【Key words】Electroacupuncture; Insulin resistance; Endothelium dysfunction; Oxidative stress

通讯作者:易玮(1966-)，女，教授，博士生导师，主要从事针灸治疗代谢性疾病研究。

基金项目:国家自然科学基金项目资助(No．81273845)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5703-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 010

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R245. 31+1