不同强度运动对脑缺血再灌注大鼠学习能力及氧自由基代谢的影响①

孙竹梅，赵雅宁，李建民，陈长香，赵旭，陈乃玲

不同强度运动对脑缺血再灌注大鼠学习能力及氧自由基代谢的影响①

孙竹梅1，赵雅宁1，李建民1，陈长香1，赵旭1，陈乃玲2

目的探讨不同强度运动对全脑缺血再灌注大鼠学习能力及海马区氧自由基代谢的影响。方法60只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分成假手术组(n=15)、全脑缺血再灌注组(n=15)、有氧运动预处理组(n=15)、力竭运动预处理组(n=15)。分别在术后1 d、3 d、7 d，HE染色观察海马区神经细胞形态变化，穿梭箱评测大鼠学习能力，羟胺法测定大鼠脑组织海马区超氧化物歧化酶的活性，硫代巴比妥酸法测定丙二醛水平。结果与假手术组比较，其他各组存活的神经元数目、主动回避反应率、超氧化物歧化酶活性显著降低(P＜0.001)，被动回避潜伏期、丙二醛水平显著升高(P＜0.001)。其中，全脑缺血再灌注组存活的神经元数目、主动回避反应率及超氧化物歧化酶的活性显著低于有氧运动预处理组(P＜0.001)，显著高于力竭运动预处理组(P＜0.001)，被动回避潜伏期及丙二醛水平显著高于有氧运动预处理组(P＜0.001)，低于力竭运动预处理组(P＜0.001)。结论规律的有氧运动有利于保护脑缺血大鼠的学习能力，而力竭运动则产生负面影响，可能与运动对氧自由基代谢的调节有关。

脑缺血再灌注；学习；有氧运动；力竭运动；氧自由基；大鼠

[本文著录格式]孙竹梅，赵雅宁，李建民，等.不同强度运动对脑缺血再灌注大鼠学习能力及氧自由基代谢的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21(1):26-30.

CITED AS:Sun ZM,Zhao YN,Li JM,et al.Effect of intensity of exercise on learning ability and oxygen free radical metabolism in rats after cerebral ischemia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):26-30.

脑缺血性疾病以其高致残率、高致死率、高发病率严重威胁着人类健康，它所导致的运动功能障碍及学习能力减弱已逐渐成为医学界研究的重点[1-2]。国内外越来越多的研究发现，运动可明显改善大脑的神经功能，提高学习能力[3-4]。然而，运动与学习能力的关系尚存争议。Leite等发现，有规律的运动训练可促进神经保护作用[5]；而Viña等认为，持久的高强度运动产生过量的氧自由基，增加人体脂质过氧化、谷胱甘

肽氧化和氧化蛋白的破坏，并造成中枢神经细胞凋亡数量增加[6-7]。本研究检测不同强度运动对全脑缺血再灌注大鼠海马区学习能力的变化，并从氧自由基代谢的角度探讨其机制。

1 材料和方法

1.1 材料

3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠60只：北京维通利华公司，合格证号SCXK(京)2003-003。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。ZH-PT型计算机控制动物实验跑台、ZH-CSC型穿梭实验视频分析系统：安徽正华生物仪器设备有限公司。752型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。恒温水浴箱：江苏省金坛医疗仪器厂。5417R冷冻离心机：德国Eppendorf公司。旋涡混匀器：江苏海门市麒麟医用仪器厂。

1.2 动物分组和模型制备

大鼠采用随机数字表法分成假手术组(A组，n= 15)、全脑缺血再灌注组(B组，n=15)、有氧运动预处理全脑缺血再灌注组(C组，n=15)、力竭运动预处理全脑缺血再灌注组(D组，n=15)，每组又平均分为1 d、3 d和7 d时间亚组。

A组分离暴露血管，不电凝椎动脉、不夹闭颈总动脉；B、C、D组应用改良Pulsinelli四血管阻断(4-vessel occlusion,4-VO)法[3]制备全脑缺血模型。动物术前12 h禁食，常规水合氯醛麻醉，颈正中切口，分离出双侧颈总动脉，在其下置线备用。将大鼠翻正并用立体定位仪固定头颈部，枕后部正中切口，暴露双侧第一颈椎横凸翼孔，直视下电凝椎动脉，每次电凝2～4 s，使其永久闭塞。术后大鼠缝皮回笼，24 h后以无创性微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，10 min后松开动脉夹。

参照国内外文献[6,8-9]，C、D组于造模前每日9:00开始跑台运动，跑台坡度0°。先进行适应性跑台训练7 d，分别以10 m/min、15 m/min、20 m/min的速度持续10 min，待大鼠熟悉跑台设备并能以20 m/min的速度持续跑30 min后，C组每天以20 m/min运动30 min (相当于30%最大耗氧量)，D组采用递增方式进行运动，开始速度为10 m/min，逐渐在3 min内达到19.3 m/min(相当于70%最大耗氧量)，保持速度直至力竭。判断力竭的标准：大鼠跑姿由蹬地式变为伏地式，神情倦怠，呼吸急促，滞留在跑道后1/3处3次以上，声波和光刺激驱赶无效，电刺激大鼠尾部仍跟不上预定速度。两组均持续14 d。运动预处理后立即制备成全脑缺血再灌注模型。

1.3 穿梭实验

采用ZH-CSC型穿梭实验视频分析系统(Shuttle box system)。穿梭箱内部250×185×300 mm，底部设不锈钢栅栏，使用电流作为非条件刺激，电击动物足底部。顶部设噪声发生器(铃声)作为条件刺激。大鼠分别于术后1 d、3 d、7 d放入穿梭箱，适应5 min消除探究反射后予铃声刺激5 s，继予电击30 s，间隔20 s后进入下一轮。若在铃声刺激5 s内大鼠逃向安全区，则为主动回避反应，系统自动停止当次训练；如果在铃声刺激5 s内大鼠未逃向安全区，则给予1.5 mA交流电30 s，在电击后逃向安全区为被动回避反应阳性，否则为主动、被动回避反应阴性。每只大鼠电击30次，系统自动记录遭受电击时间(被动回避潜伏期,passive avoidance latency,PAL)、主动回避反应次数等参数。主动回避反应次数占总训练次数的百分比即为主动回避反应率(active avoidance reaction rate, AARR)。学习成绩用主动回避反应率和被动回避潜伏期评价。

1.4 HE染色

术后1 d、3 d、7 d，各组大鼠10%水合氯醛300～350 mg/kg腹腔注射麻醉，开胸、暴露心脏，4%多聚甲醛心脏灌流，断头取脑，切取约2 mm厚冠状背侧海马，立即以4℃4%多聚甲醛固定。24 h后常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋、切片与贴片，切片厚4 μm；45℃恒温箱烤干，常规脱蜡、脱水，苏木素及伊红染色，中性树胶加盖玻片封固。在光学显微镜(40×10)下观察神经元形态变化。每只动物取6张海马CA1区切片，Motic-6.0图像采集及图像分析系统计数高倍视野下的存活与坏死的神经细胞数，取均值。

1.5 SOD、MDA检测

按时间点将各组大鼠处死后，迅速取双侧海马区组织，称重，加冰盐水制成5%组织匀浆，取上清，依次加入SOD检测试剂，旋涡混匀器混匀，37.5℃水浴40 min，冷却，加入显色剂。利用725分光光度仪，波长调至550 nm处，将配好的试剂放进1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，测定各管吸光度值，按说明计算SOD含量。

同法处死大鼠取材并加入MDA检测试剂，旋涡

混匀器混匀，试管口用封口膜扎紧，针头刺一小孔，95℃水浴40 min，流水冷却，3500～4000 r/min离心10 min。取上清，利用725分光光度仪，波长调至532 nm处，将配好的试剂放进1 cm光径比色杯，用蒸馏水调零，测定各管吸光度值，按说明计算MDA含量。

1.6 统计学分析

采用Excel建立数据库，应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。数据以(±s)表示，采用单因素方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 形态学

A组大鼠海马区神经元细胞形态饱满，排列整齐紧密，胞核规则，核仁清晰。B组神经元细胞出现核固缩、深染，部分神经元胞核完全消失，形成空泡状结构。C组存留部分形态正常神经元细胞，坏死神经元细胞减少，神经细胞固缩深染现象减轻。D组神经细胞破坏严重，可见较多坏死神经细胞失去正常形态，出现胞核与胞质界限不清、核固缩、深染现象(图1)。图像分析结果显示，与A组比较，其他各组各时间点神经元坏死率较高(P＜0.05)；其中B组神经元坏死率高于C组(P＜0.05)，低于D组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠海马区神经元细胞坏死率比较(%)

图1 各组大鼠缺血3 d后海马区CA1区神经元(HE染色，400×)

2.2 穿梭实验

与A组相比，其他各组各时间点AARR均降低，APL明显延长；D组较B组自发运动量进一步下降，对电击刺激反应迟钝；C组较B组反应灵敏，能够多次有效躲避电击。B组AARR低于C组，高于D组，APL时间高于C组，低于D组(均P＜0.05)。见表2。

2.3 SOD和MDA

与A组相比，其他各组各时间点SOD活性明显降

低，MDA活性明显升高；B组SOD活性明显低于C组，高于D组；MDA活性高于C组，低于D组(均P＜ 0.05)。见表3。

表2 各组大鼠穿梭实验结果比较

表3 各组大鼠SOD和MDA比较(nmol/mg)

3 讨论

学习能力是大脑主要的高级神经功能之一，是人和动物生存发展的重要功能。缺血性脑疾病常导致患者出现学习功能障碍，延迟其功能恢复，加重痴呆。运动疗法以其简单易行性、普遍性以及与学习能力的密切关联被医学界广泛认可，然而运动的强度仍是广大学者关注和研究的热点。

本研究显示，力竭运动会加重脑缺血后海马区神经元细胞的死亡，并导致学习能力下降；而有氧运动会促进神经元细胞再生，使缺血再灌注大鼠的学习能力提升。说明有氧运动能改善缺血后神经元细胞的功能及神经元发生水平，有利于学习能力的维持，与国外学者研究结果一致[10-11]。Ramsden等发现，大鼠以10 km/d的强度持续15 d能够减缓神经元丢失，但以超过12 km/d的强度持续15 d后，却加速神经元的丢失[12]。本研究也发现，持久的大强度运动(19.3 m/min,3 h)会导致缺血再灌注大鼠海马区神经元细胞进一步丢失与退化，影响神经功能的恢复并减退其学习能力。提示在临床工作中，我们应指导人们选择合适的运动强度进行有氧训练，切勿急于求成。

氧自由基在脑缺血后神经元损伤中起着至关重要的作用。氧自由基增加导致脂质、蛋白质和DNA氧化损伤，加剧脑缺血再灌注过程中的组织学损伤[13]。姜招峰等发现，海马及皮质氧自由基损伤的大鼠，学

习记忆能力较正常大鼠低下[14]。本研究显示，力竭运动造成脑缺血再灌注大鼠海马区SOD活力下降，MDA含量增加，加重氧自由基损伤；而有氧运动与之相反，能提高机体清除氧自由基及脑细胞抗氧化的能力。国内外学者发现，有氧运动预处理能够通过促进脑组织氧化性损伤的减少、增强抗氧化活性来改善脑缺血带来的运动功能障碍和脑损伤；而长期超负荷运动，由于蛋白质分子的氧化修饰及运动过程中活性氧产生增多，诱导产生氧化应激，并通过缺血后脑细胞凋亡参与缺血损伤，使认知功能下降对其学习记忆功能有明显损害[13,15-16]。与本研究基本一致。

本研究显示，规律的有氧运动通过维持脑缺血动物神经细胞正常形态及功能、调控氧自由基代谢，能促进脑缺血再灌注后学习能力的恢复。提示运动训练应遵循适量、适度原则，不能忽略氧自由基积累的后果，以免加重脑缺血后进一步损伤以及疾病的康复。

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Effect of Intensity of Exercise on Learning Ability and Oxygen Free Radical Metabolism in Rats after Cerebral Ischemia-reperfusion

SUN Zhu-mei,ZHAO Ya-ning,LI Jian-min,CHEN Chang-xiang,ZHAO Xu,CHEN Nai-ling.Rehabilitation and Nursing College,Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China

Objective To explore the effetc of different intensity of exercise on learning ablility and oxygen free radical metabolism in rats after cerebral ischemia-reperfusion(I/R).Methods 60 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group,I/R group, aerobic exercise preconditioning group and exhaustive exercise preconditioning group.The morphological changes of neural cells in hippocampus were observed with HE staining,the learning ablility was assessed with shuttle box,the activity of superoxide dismutase and malondialdehyde level in hippocampus were measured with hydroxylamine method and TBA method respectively 1,3,7 days after injury.Results The number of survival neurons,active avoidance reaction and activity of superoxide dismutase decreased,and the latency of passive avoidance and malondialdehyde levels increased in all the other groups compare with the sham group(P＜0.001).Further more,the number of surviving neurons,active avoidance reaction rate and the activity of superoxide dismutase were less in the I/R group than in the aerobic exercise preconditioning group(P＜0.001),and more than in the exhaustive exercise preconditioning group(P＜0.001),while the latency of passive avoidance and the level of malondialdehyde was more than in the aerobic exercise preconditioning group(P＜0.001),and less than in the exhaustive exercise preconditioning group(P＜0.001).Conclusion Regular aerobic exercise is beneficial to protect the learning ability from cerebral I/R in rats,but exhaustive exercise may be negative,which may associated with the metabolism of oxygen free radical in hippocampus impacted by exercise.

cerebral ischemia-reperfusion;learning;aerobic exercise;exhaustive exercise;oxygen free radical;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.007

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0026-05

2014-07-31

2014-09-01)

河北省教育厅重点资助项目(No.ZH2012046)。

1.河北联合大学康复医学院，河北唐山市063000；2.河北联合大学口腔医学院，河北唐山市063000。作者简介：孙竹梅(1988-)，女，汉族，河北唐山市人，硕士研究生，主要研究方向：脑创伤与脑保护。通讯作者：李建民，男，博士，教授。E-mail:zyning789@126.com。