树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞对人体影响的实验研究

张洪超

（黑龙江省医院普外一科，黑龙江 哈尔滨 150300）

·临床论著·

树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞对人体影响的实验研究

张洪超

（黑龙江省医院普外一科，黑龙江 哈尔滨 150300）

目的探究树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK）细胞输注对胰腺肿瘤患者的影响。方法对30例经病理证实的胰腺肿瘤患者输注自体DC-CIK细胞，每例均在输注前、后抽取血液，应用流式细胞技术测量T细胞亚群和CD4+CD25+CD127low调节性T细胞（Treg）的改变；ELISA法测量IFN-γ和IL-4数值的变化。结果患者输注后外周血CD3+、CD4+、CD3+CD56+T细胞含量增加，CD4+/CD8+含量增加，CD8+T细胞含量减少（P＜0.01）；CD4+CD25+CD127lowTreg减少（P＜0.01）；Th1细胞因子IFN-γ含量较输注前增加，而Th2细胞因子IL-4含量减少（P＜0.01）。结论DC-CIK细胞输注可以改善胰腺肿瘤患者的免疫机能，加强人体的抗肿瘤免疫应答，是治疗胰腺肿瘤患者的一个方法。

树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞；胰腺肿瘤；T淋巴细胞

生物治疗已经成为一个新的常规抗肿瘤疗法，也为晚期不适合手术或者承受不住其他疗法的患者开辟了一个新的治疗途径。胰腺肿瘤是常见的消化系恶性肿瘤。初期无明显症状，当出现黄疸或疼痛时为时已晚，或有远处转移，或肿瘤已固定不能切除，治疗困难。即使可以手术治疗，因该手术损伤大且易复发，术后需配合化疗，患者机体承受打击大，免疫力明显降低，这时，生物治疗是这一患者可以采取的

有效治疗措施，甚至首选治疗措施。树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞（dendritic cells-cytokine induced killer cells，DC-CIK）是近些年发展起来的新型高效的生物活性细胞，国内外已广泛开展治疗癌症方面的科研和临床治疗[1-2]。现在报道证实，经过手术或化疗的患者免疫机能下降，给予DC-CIK细胞治疗可以让患者在治疗肿瘤的同时，免疫机能得到提高，在提高继续接受治疗的能力和提高患者生存质量方面都有重要意义[3]。不过，在胰腺肿瘤治疗方面的文献不多，本文通过免疫指标的测量，对给患者输注DC-CIK细胞前后指标的量化对比，观察DCCIK细胞生物治疗对胰腺肿瘤患者的作用。

1 资料与方法

1.1研究对象

选取普外科2010年5月-2012年12月收治的胰腺肿瘤患者共30例。其中男18例，女12例，年龄40～70岁。全部患者都是胰腺肿瘤确诊病例，全部病例按国际抗肿瘤联盟（UICC）标准给予分期（TNM分期），Ⅰ～Ⅱ期9例，Ⅲ期12名，Ⅳ期9例。全部患者卡氏评分≥60分，心、肾、肝脏功能均正常。所有均是根治手术后患者，术后给予采自自身的DC-CIK细胞输注，全部患者在输注DC-CIK细胞前，医生都与家属及患者本人进行沟通，本人及家属均表示同意，并签字。

1.2主要试剂

rhINF-γ购自上海克隆生物技术公司，抗人CD3单克隆抗体购自eBioscience公司，人rhIL-4、rhIL-2、rhIL-1a、rhGM-CSF购自PeproTech公司，Ficoll液、人无血清培养基AIM-V购自美国GIB-CO公司，FITC标记鼠抗人CD3、CD127单克隆抗体、PE标记鼠抗人CD8、CD4、CD56单克隆抗体、PE-Cy5标记鼠抗人CD25单克隆抗体和同型对照IgGα1购自美国BD公司，人IFN-γ、IL-4酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自晶美生物工程有限公司，rhGMCSF（注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子）购自厦门特宝生物工程股份有限公司。

1.3实验方法

1.3.1树突状细胞的制备所有操作严格遵守标准程序。采集患者外周血2×109～3×109个单个核细胞及血浆80 ml（Kabi Fresenius，German）。经Ficoll Hypaque（Gibco，USA）分离单个核细胞后，离心洗涤重悬，调整细胞浓度为2×106～4×106个/ml铺入6孔板，培养箱中孵育2 h后，收集悬浮细胞至另一个50 ml离心管继续培养；第3天补加树突状细胞（dendritic cells，DC）培养液；第5天加入肿瘤特异性抗原（终浓度为20～80μg/ml），诱导后12～16 h加入肿瘤坏死因子（TNF-α，500 U/ml）；第8天收集细胞，离心，洗涤，用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬，总体积为100 ml，静脉回输患者，共4次，回输时间选择在2次DC回输之间。

1.3.2细胞因子诱导的杀伤细胞制备将经Ficoll Hypaque（Gibco，USA）分离的单个核细胞重悬于含10%FBS的RPMI 1640培养液中，以2×106个/ml铺入培养瓶，补加γ-干扰素（INF-γ，1 000 U/ml），置于37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育；次日补加CD3单抗（0.5μg/ml）及白细胞介素-2（IL-2，1 000 U/ml）继续培养；第3天用10%FBS的RPMI-1640培养液进行补液；第11～12天收集细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer，CIK）细胞，离心，生理盐水洗涤3次。用含有10%患者自身血浆的生理盐水重悬，总体积为100 ml，经静脉回输患者，共4次，回输时间选择在2次DC回输之间。

1.3.3DC-CIK回输后效果分析如果输入DC-CIK后患者有发热等不舒服的感觉，各项化验有一定的改变，且对患者的生活有严重的影响，这些是评价的指标。

1.3.4患者血液中免疫指标细胞对采集及分析在回输DC-CIK之前7 d抽取患者血液，并于输注DC -CIK细胞后14 d再次抽取血液，经过处理后，分别加入管中，小管中加入血液及相应的抗体，血液加100μl，抗体量为10μl，抗体分别是CD3-FITC、CD127-FITC、CD4-PE、CD8-PE、CD56-PE、CD25-PE-Cy5，用IgGα1做相应的对照，2者经过反应后，时间是15 min，反应后再次经过处理，上仪器检测，检测后行记录数据分析总结。

1.3.5检测Th1/Th2按前述回输DC-CIK之前7 d抽取患者血液，并于输注DC-CIK细胞后14 d再次抽取血液，经过离心等处理后，留取患者血清，置入冰箱低温冷冻备用。取ELISA试剂盒，按操作程序测定IFN-γ与IL-4血清中的含量，操作务求规范严密。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，实验设计为自体配对均数的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1效果及副反应

总体上，DC-CIK注入人体后，多数患者状态有明显改善，进食增加、精力恢复、乏力倦怠症状消失，其中有个例患者有暂时的体温升高现象，均未超过39℃，时间较短，应用药物后，体温下降至正常，并没有反复，全部患者无皮疹瘙痒等不良症状，各项化验指标也未见显著变化。

2.2患者免疫指标评价

DC-CIK注入人体后，患者CD3+、CD4+百分比增加，CD8+百分比下降，CD4+/CD8+数值提高；标志CD3+CD56+细胞数量提升；标志CD127lowTreg CD25+CD4+细胞比例下降，相比注入CIK-DC细胞前，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 患者输注前后T淋巴细胞表面标记的变化（%，n=30）

2.3细胞因子比较

CIK-DC细胞输注组IFN-γ含量提高，IL-4含量减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 患者输注前后外周血细胞因子IFN-γ和IL-4的比较（pg/ml，n=30）

3 讨论

胰腺癌是消化道常见肿瘤，恶性程度高，治疗困难，晚期放化疗都难以延长生存期，临床及科研都在多方探索有效的疗法。治疗的主要难度在于复发和转移，手术前治疗重点在局部，术后治疗重点在于全身，近年开展的生物治疗是有希望的全身治疗办法。

自身防御机制在抗肿瘤过程中发挥着不可替代的作用，T细胞在自身防御的过程中发挥着重要作用，癌症之所以能发生、发展，在于机体免疫状态有了问题，导致免疫监视减弱，正常状态下，人体免疫细胞量和功能都协调一致，能够发挥正常的免疫机制，当这种平衡被打破，免疫功能在一定程度上的缺失，至使肿瘤产生免疫逃逸。实验证明，DC-CIK的输注可以改善患者的免疫状态，是一种有效的支持治疗。患者免疫状态的改善对患者的无病生存期及带瘤生存期的延长都有一个良好的预期。DC细胞是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给患者，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应[4]。最新研究显示，DC细胞与CIK细胞共培养后，提高细胞的增殖速度和杀伤活性，且使其对肿瘤细胞的杀伤作用更具特异性。对于血液、消化、呼吸等多个系统肿瘤细胞均有杀伤作用。CIK细胞最初是指在正常人体外周血中只占1%～5%的CD3+CD56+的T淋巴细胞，目前国内外制备的用于过继免疫治疗的CIK细胞，实际上是体外扩增以CD3+CD56+、CD3+CD8+为主的异质性细胞群[5]。该细胞群具有广泛的非MHC限制的极强的溶瘤活性。CIK增殖能力强，细胞毒作用强，对肿瘤细胞的识别能力很强，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。能消除残留微小的转移病灶，对手术后或放化疗后患者效果显著，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

本文结果表明经过以往的治疗后，机体的免疫力受到不同程度的打击和抑制，有些已不能进行下一步治疗。经过DC-CIK细胞的提取和输注后，CD3+、CD4+含量和CD4+/CD8+数值升高，共表达CD3+CD56+细胞含量显著提高。CIK细胞对肿瘤细胞有直接的杀伤，在体内受某些淋巴因子作用后，CIK细胞大量释放具有细胞毒性的胞浆颗粒到胞外，这些颗粒直接破坏瘤细胞，进入体内活化的DC-CIK细胞分泌多种细胞因子，如干扰素γ、TNF-α和IL-2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，而且还可通过调节免疫系统间接杀伤肿瘤细胞。

1995年SAKAGUCHI等人首先提出CD4+CD25+Treg，引起免疫界越来越多的关注。CD4+CD25+Treg细胞可以维持自身免疫耐受，由于肿瘤抗原是自身抗原量或质的改变，因此，可以推测CD4+CD25+Treg细胞可以抑制肿瘤免疫的发生。研究发现无论癌症患者还是肿瘤动物模型，其外周CD4+CD25+Treg细

胞数量及功能均不同程度地增高，与患者死亡率增加，存活率降低密切相关。去除CD4+CD25+Treg细胞，利于诱导对多种肿瘤抗原的免疫应答，证明CD4+CD25+Treg细胞可以抑制体内抗肿瘤免疫反应。因此，CD4+CD25+Treg细胞可能在肿瘤逃逸、促进肿瘤的生长中发挥重要作用，也可能是肿瘤疫苗和免疫增强剂难以奏效的原因。

文献显示CD4+CD25+CD127lowTreg是人体自有的，可以识别身体内被激活的T淋巴细胞[6]，对Treg尤其可以区别，其特异性在目前发现的细胞标志中可以说是高的，而这种技术的发现，已经在临床中得到应用，效果良好。应用流式细胞术三色标记法检测患者血液里CD4+CD25+CD127lowTreg含量，可以对Treg在血液中的含量反映得更精准。上述研究检测DC-CIK细胞输注前后血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量，可以看出胰腺肿瘤患者输注DC-CIK前血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量较多。DC-CIK细胞输注2星期，患者血液中CD4+CD25+CD127lowTreg含量减少。因而，CIK细胞以减少Treg含量的方式增强患者的免疫功能。

人体的免疫结构中，细胞因子有着重要的地位。从产生细胞因子和其功能作用的区别，细胞可区分为Th1细胞与Th2细胞。Th1的细胞作用是使人免疫力更强，这类细胞可以分泌诸如IFN-γ、IL-2等因子；Th2细胞分泌诸如IL-4、IL-10等因子，在体液免疫中发挥关键效能。健康状态下，人体处在一个免疫平衡状态，Th1、Th2分别分泌增强免疫和抑制免疫的因子[7]，互相制衡。肿瘤患者疾病的开始及进展均有Th1参与的免疫机能伴随。上述通过检测两类细胞因子在血液中的含量，可以看出输注DC-CIK细胞的患者，IFN-γ含量增加，IL-4含量减少。显示DC-CIK细胞输注在一定程度上影响着Th1/Th2的平衡，保持人体免疫状态的平衡，促进免疫系统对肿瘤的免疫反应。

总之，DC-CIK细胞输注对增强胰腺肿瘤患者T淋巴细胞生理效能，减少患者血液中Treg的含量，同时使Th1/Th2的比例保守一个相对稳定的水平起到关键作用。但是，上述论述所涉范围有限，DC-CIK细胞对胰腺肿瘤患者更深层次的作用及效果还有待揭示。

[1]ME SIANOG,TODOROVICM,GAMMAITONI,etal.Cytokine-induced killer(CIK)cells as feasible and effective adoptive immunotherapy for the treatment of solid tumous[J].Expert Opin Biol Ther,2012,12(6):673-684.

[2]PANG J,GAO X,LIU X,et al.Enhanced antitumor effects by the co-culture of allotumou RNA-pulsed dendritic cells with autologouscytokine-inducedkillercellsonhormone-refractory prostate cancer[J].Cancer Invest,2007,25(7):527-534.

[3]LIN G,WANG J,LAO X,et al.Interleukin-6 Inhibits regulatory T Cells and improves the proliferation and cytotoxic activity of cytokine-induced killer cells[J].J Immunother,2012,35(4):337-343.

[4]LI H,WANG C,YU J,et al.Dendritic cell-activatde cytokine-inducedkillercellsenhancetheanti-tumoreffectof chemotherapy on non-amall cell lung cancer in patients after surgery[J].Cytotherapy,2009,11(8):1076-1083.

[5]BEYER M,SCHULTZE JL.Regulatory T cells in cancer[J]. Blood,2006,108:804-811.

[6]LIU W,PUTNAM AL,XU-YU Z,et al.CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+Treg cells[J].J Exp Med,2006,203(7):1701-1711.

[7]CHENJ,HUANGX,HUANGG,etal.Preconditioning chemotherapy with Cisplatin enhances the antitumor activity of cytokine-induced killer cells in a murine melanoma model[J]. Cancer Biother Radiopharm,2012,27(3):210-220.

（张蕾 编辑）

Effect of dendritic cell-cytokine induced killer cells on human pancreatic cancer

Hong-chao ZHANG
(The First Department of General Surgery,Heilongjiang Provincial Hospital, Harbin,Heilongjiang 150300,P.R.China)

【Objective】To study the effect of dendritic cell-cytokine induced killer cells(DC-CIK)immunotherapy on immunity function of patients of pancreatic cancer.【Methods】A total of 30 patients with pathologically confirmed pancreatic cancer were treated with DC-CIK cell therapy.The levels of T cell subsets and CD4+CD25+CD127 low regulatory T cells were detected with flow cytometry and the IFN-γ and IL-4 were detected with ELISA in peripheral blood before and after treatment.【Results】The T cell subsets CD3+,CD4+and CD3+CD56+,and the ratio of CD4+/CD8+were increased after DC-CIK cell transfusion while the CD8+cell subset and CD4+CD25+CD127 low regulatory T cells were significantly decreased(P＜0.01).The level of IFN-γ was increased and the level of IL-4 decreased at the same time(P＜0.01).【Conclusions】DC-CIK cell immunotherapy can improve the immune function of patients with pancreatic cancer and enhance the anti-tumor effects,so it is one of means which can be used to treat patients with pancreatic cancer.

dendritic cell-cytokine induced killer cell;pancreatic cancer;T lymphocyte

R735.9

A

1005-8982（2015）27-0032-04

2015-03-14