重组赖氨酸内肽酶构建表达及活性方法研究

马 妍，付志成，范 开

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054;2.富进生物医药有限公司，重庆 400041)

据世界卫生组织预测，至2025年全球糖尿病患者人数将是目前的2倍，达3亿人［1］，而胰岛素(insulin，Ins)是所有1型糖尿病和多数2型糖尿病患者的主要治疗药物。人类胰岛素基因位于11号染色体短臂近末端处P15.5，由1789个碱基对组成，它包括3个外显子和2个内含子［2］。

在胰岛素的生物合成过程中有一个疏水的肽链与胰岛素原的B链N端相连，这种形式的胰岛素被称为前胰岛素原(preproinsulin)［3］。这个接在B链N端的疏水肽链是信号肽，其作用是引导新合成的胰岛素原穿过内质网膜。胰岛素是胰岛素原经过胰蛋白酶和类羧肽酶B等类似蛋白酶的作用，切去C肽及两端的碱性氨基酸产生的［4］。

胰岛素的生物合成过程包括前胰岛素原的mRNA在内质网的向内质面被翻译成一条肽链的前胰岛素原，新生的多肽链在信号肽的引导下穿过内质网膜进入内质网腔，同时移去信号肽成为胰岛素原;然后胰岛素原进入高尔基体，经过折叠、硫硫配对和包装进入分泌颗粒;最后由类似胰蛋白酶和羧肽酶B的专一的蛋白水解酶加工成两条链的胰岛素和C肽，并等分子释放到血液中。由此可见，从合成到成熟，胰岛素有3种存在形式:前胰岛素原(mRNA翻译产物，含信号肽);胰岛素原(折叠产物，缺少信号肽);胰岛素(成熟产物，由 A、B 两条链组成，缺少 C 肽)［3］。

赖氨酸內肽酶(Lysyl C-peptide，Lys-C)是可以特异性切除赖氨酸基团C末端的多肽［5］的一种酶。目前使用的赖氨酸内肽酶价格昂贵，必须从天然菌种中提取，而且不能很好地应用于大规模生产。本研究用重组方法克隆表达赖氨酸内肽酶，该方法简单，表达量高，具有价廉、无污染等特点。重组的赖氨酸内肽酶应用于胰岛素的制备工艺中，与天然的赖氨酸内肽酶相比具有相同的作用。

Achromobacter lyticus来源的Lys-C蛋白酶原前体由4部分组成:N端20AA信号肽(pre-peptide，signal peptide)、185AA 前导肽(pro-peptide)、268AA成熟 Lys-C蛋白酶(mature protein)及180AA C端延伸肽(C-terminal extension peptide)。本实验前期研究结果表明，酵母重组表达448AA成熟Lys-C蛋白酶和C端延伸肽无法获得活性Lys-C蛋白酶。根据文献资料，需重组表达完整的Lys-C蛋白酶原前体方可得到活性Lys-C蛋白酶［6］。鉴于此，计划全基因合成185AA前导肽cDNA，并将其与已有成熟Lys-C蛋白酶和C端延伸肽cDNA拼接，获得全长Lys-C蛋白酶原前体，再次进行毕赤酵母重组表达。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

PMD19-T-Lys-C，设计的cDNA委托宝生物工程有限公司进行全基因合成。

Lysyl Endopeptidase(以下简称 Wako酶)，购自日本和光纯药工业株式会社;羊抗兔二抗，购自Jackson;小量质粒抽提试剂盒和DNA小量胶回收试剂盒，购自美国Omega公司。

本研究设计了pPICZαA-Lys-C蛋白氨基酸序列，并根据酵母密码子偏爱性原则设计cDNA序列。设计的cDNA委托宝生物工程(大连)有限公司进行全基因合成。

1.2 方法

1.2.1 pPICZαA-Lys-C 目的基因的获得

根据Codon Usage database(http://www.kazusa.or.jp/codon/)P.Pastoris 密码子使用偏好性数据［7］，设计了 pPICZαA-Lys-C 的 CDNA，其中包括TGA和TAA两个终止密码子序列，并在序列5'端和3'端分别设计Xho I(CTCGAG)和Not I(GCGGCCGC)限制性酶切位点。其中Lys-C的序列为:

MKRICGSLLLLGLSISAALAAPASRPAAFDYAN LSSVDKVALRTMPAVDVAKAKAEDLQRDKRGDIP RFALAIDVDMTPQNSGAWEYTADGQFAVWRQRV RSEKALSLNFGFTDYYMPAGGRLLVYPATQAPAG DRGLISQYDASNNNSARQLWTAVVPGAEAVIEAVI PRDKVGEFKLRLTKVNHDYVGFGPLARRLAAASG EKGVSGSCNIDVVCPEGDGRRDIIRAVGAYSKSGT LACTGSLVNNTANDRKMYFLTAHHCGMGTASTAA SIVVYWNYQNSTCRAPNTPASGANGDGSMSQTQS GSTVKATYATSDFTLLELNNAANPAFNLFWAGWDR RDQNYPGAIAIHHPNVAEKRISNSTSPTSFVAWGGG AGTTHLNVQWQPSGGVTEPGSSGSPIYSPEKRVLG QLHGGPSSCSATGTNRSDQYGRVFTSWTGGGAAA SRLSDWLDPASTGAQFIDGLDSGGGTPNTPPVANF TSTTSGLTATFTDSSTDSDGSIASRSWNFGDGSTST ATNPSKTYAAAGTYTVTLTVTDNGGATNTKTGSVT VSGGPGAQTYTNDTDVAIPDNATVESPITVSGRTGN GSATTPIQVTIYHTYKSDLKVDLVAPDGTVYNLHNR TGGSAHNIIQTFTKDLSSEAAQRAPGSCG

将对应的甘油菌接种并抽提质粒，得到含有Lys-C目的基因的质粒pMD19-T-Lys-C。

1.2.2 pPICZαA-Lys-C 重组质粒的构建及鉴定

本项目中拟构建重组质粒为pPICZαA-Lys-C，需要先构建目的片段Lys-C和载体pPICZαA，再将Lys-C嵌入到 pPICZαA载体中，构建重组质粒pPICZαA-Lys-C。

1)pPICZαA载体和Lys-C目的片段的双酶切

用Xho I、Not I分别双酶切空载体 pPICZαA质粒及目的片段Lys-C质粒。150 μL反应体系如表1所示。

表1 Xho I+Not I双酶切体系

混匀后放入37℃恒温箱，反应1 h。将酶切产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，然后根据美国Omega公司小量胶回收试剂盒的方法，回收约3600 bp的 pPICZαA片段和1930 bp的 Lys-C片段。

2)pPICZαA载体与Lys-C目的片段的连接

利用ChampGel 5000数码凝胶成像分析系统计算胶回收产物的DNA含量，按载体与插入目的片段摩尔比1∶5设计连接反应体系，如表2所示。

将上述反应体系放入 PCR仪，16℃连接过夜。

3)大肠杆菌感受态细胞制备

根据文献［8］中的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，将－80℃保存的 E.Coli Top10F’菌种迅速融化，取20 μL接种于5 mL灭菌LB培养液中，在30℃、150 r/min摇床培养12～16 h;将过夜培养的E.Coli Top10F’按1∶100比例转接至新鲜的LB培养液中，37℃，220 r/min摇床培养至OD600值为0.3～0.5;取1 mL菌液至1.5 mL EP管中，冰浴放置10 min，然后于4℃、5000 r/min离心5 min;弃上清，用400 μL 预冷0.1 mol/L CaCl2悬浮(轻轻吹打分散菌体)于冰水混合物中放置10 min，然后于4℃、5000 r/min离心5 min;弃上清，用100 μL 0.1 M CaCl2悬浮(轻轻吹打分散菌体)于冰水混合物中放置20 min，放－80℃冰箱备用。

表2 pPICZαA-Lys-C连接体系

4)连接产物转化

将－80℃保存的E.Coli Top10F’感受态细胞迅速融化，取20 μL连接液与感受态细胞混匀，于冰水混合物中放置30 min，然后于42℃水浴热休克90 s，迅速放置冰水浴2 min;每管各加300 μL LB培养液，于37℃、220 r/min摇床培养45 min;取100 μL培养菌液涂布 LB+Zeocin平板，于37℃培养箱中正放30 min后倒置培养过夜。

5)重组质粒pPICZαA-Lys-C筛选及鉴定

利用重组子上带有的博莱霉素抗性基因进行筛选。比较pPICZαA-Lys-C与阴性对照平板上单菌落个数，如果阴性对照平板生长的菌落较多，说明载体酶切不完全，则要重新酶切、连接。若pPICZαA-Lys-C平板上菌落明显多于阴性对照平板单克隆，则可进行下一步阳性克隆筛选。

挑取5个pPICZαA-Lys-C转化子分别接种于5 mL LB-Zeocin液体培养基中，37℃、150 r/min培养过夜，提取质粒进行重组质粒双酶切鉴定。按照美国Omega公司小量质粒抽提试剂盒的方法，将培养过夜菌体提取质粒并利用Xho I、Not I进行双酶切。将反应体系混匀放置于37℃恒温箱1 h，酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

6)pPICZαA-Lys-C重组质粒保存

将上述鉴定正确的重组克隆宿主菌命名为pPICZαA-Lys-C/Top10F’。将该菌体在 LB-Zeocin平板扩增后，挑取菌苔，接种于含25 μg/L Zeocin的LB液体培养基中于37℃、220 r/min培养，待OD600值达到0.6时分装，每管补入终浓度为15%的甘油后放置于－80℃低温冰箱中保存。同时用质粒提取试剂盒提取一定量该质粒，分成10 μL/支，保存于-80℃低温冰箱中。保存质粒前进行了Xho I、Not I双酶切鉴定，以确保经鉴定的质粒正确。

1.2.3 重组表达菌株的构建和筛选

1)毕赤酵母电转化、质粒线性化以及感受态细胞的制备

根据文献［9－10］，挑取毕赤酵母X-33单菌落接种到装有5 mL YPD培养基的50 mL三角瓶中，30℃、250 r/min培养过夜。取1 mL过夜菌液到20 mL YPD 中，30 ℃、250 r/min培养，OD600值为1.2～2.0时收菌。将20 mL菌液移入离心管，4℃、1500 g离心5 min，无菌彻底去掉上清。用1 mL 1 mol/L D-Sorbitol悬浮菌体，装入 1.5 mL EP管中，4℃、1500 g离心3 min，无菌去掉上清。用1 mL 1mol/L D-Sorbitol悬浮菌体，4℃、1500 g离心3 min反复5次。用500 μL 1 mol/L D-Sorbitol悬浮菌体，冰水浴备用。

根据DNA浓度及限制性内切酶使用说明设计反应体系如表3所示。

混匀，37℃恒温箱3 h，电泳鉴定线性化酶切效率，用酚氯仿法回收线性化质粒。酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液抽提一次，取上清后加入0.1倍体积的3M乙酸钠(pH值3.0)，混匀后加入2.5倍体积－20℃预冷的无水乙醇，在－20℃放置2 h以上以沉淀DNA。然后以10000 g离心5 min，弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀2次;在37℃恒温箱放置15 min左右使乙醇挥发，晾干DNA沉淀。用20 μL DDW 重新溶解DNA。

表3 重组pPICZαA-Lys-C质粒线性化体系

电泳鉴定回收后的质粒线性化是否完全，并估计DNA的浓度，保存于－20℃，使用前按需要浓度溶解DNA。

取100 μL菌液至预冷的0.2 cm电转杯中，加入线性化的质粒10 μL混匀，置冰上10 m(或－20℃放置1 min)。将电转杯放入电转仪中电转 (电压1.5 kV，电击时间1.5 ms)。立即用1 mL 1 mol/L预冷的D-Sorbitol到电转杯悬浮菌体。取200 μL菌液涂布YPD－Zeocin平板，平放30℃烘箱20～60 min，再倒放培养3～7天。

2)pPICZαA-Lys-C毕赤酵母重组子的筛选与鉴定

将pPICZαA-Lys-C/X-33转化混合液转接于含 200 μg/mL Zeocin 的 YPD 培养基中［11-12］，30℃过夜培养。将过夜培养物接种于100 mL BMGY培养液的1 L摇瓶中，30℃摇床培养约16 h至OD600为10时换用BMMY培养液100 mL 30℃继续培养96 h，按终浓度为0.5% 每隔24 h补加甲醇并取样保存。诱导96 h后离心收集上清，保存。将不同诱导表达时间的上清进行TCA沉淀，8 M Urea溶解后还原Buffer处理，进行12% 预置胶SDS-PAGE电泳检测上清中 pPICZαA-Lys-C表达情况。

挑取pPICZαA-Lys-C/X-33的YPD平板(含200 μg/mL Zeocin)接种于100 mL BMGY 培养液的1 L摇瓶中，30℃摇床培养约16 h至OD600为10时换用BMMY培养液100 mL 30℃继续培养96 h，按终浓度为0.5% 每隔24 h补加甲醇并取样保存。诱导96 h后的各单菌落摇瓶培养液离心收集上清，保存。取不同诱导表达时间的上清同上处理后电泳检测。

1.2.4 Lys-C酶免疫斑点鉴别实验

TG缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷15.12 g和甘氨酸72 g，加水溶解并稀释至500 mL，4℃保存。EBM缓冲液:取 TG缓冲液 20 mL、甲醇40 mL，加水稀释至200 mL，4℃保存。TTBS缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷12.1 g，氯化钠9.0 g，吐温－201.0 mL，加适量水溶解，用盐酸调pH值至7.5，加水稀释至1000 mL，4℃保存。底物缓冲液:取 3，3‘-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)15 mg，加甲醇 5 mL，30% 过氧化氢 15 μL，并加入25 mL TTBS 缓冲液使其溶解［13］。

封闭液:TTBS缓冲液+5%脱脂奶粉。稀释液:TG缓冲液稀释4倍加1%BSA，即50mM Tris-Gly+1%BSA。样品的制备:Wako公司Lys-C酶作为阳性对照;本公司酵母诱导表达Lys-C酶上清TCA沉淀处理回收处理样品;阴性对照为稀释液，分别取5～10 μL点膜。

将硝酸纤维素膜用EBM缓冲液浸泡15 min后，取出干燥30 min;阳性对照品、供试品及阴性对照品分别取样点膜。室温干燥60 min;硝酸纤维素膜浸入封闭液中封闭处理，在杂交摇床上室温摇动温育60 min;弃去液体，加入含1∶1000抗Lys-C兔多抗的TTBS缓冲液25 mL，室温摇动温育2 h;取出硝酸纤维素膜，用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液洗3次，每次8 min;弃去液体，加入含1∶5000 HRP酶联标记羊抗兔IgG的TTBS缓冲液25 mL，室温摇动温育60 min;取出硝酸纤维素膜，用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液洗4次，每次8 min;弃去液体，加入适量底物缓冲液置于室温避光条件下显色，斑点显色清晰时用水洗终止反应。结果判定:阳性结果应呈现明显色带，阴性结果不显色。

1.2.5 重组赖氨酸内肽酶酶切RP-HPLC法活性测定

根据免疫斑点法，得到 pPICZαA-Lys-C有表达的菌体，将有表达的pPICZαA-Lys-C诱导96 h的上清用3M硫酸铵沉淀，在操作过程中要注意边加边摇，4°C静置12 h。将加有3M硫酸铵的pPICZαA-Lys-C上清5000 g，10 min离心弃上清，并用50 mM，pH值 9.0的 Tris溶液溶解，再用50 mM，pH值8.0的Tris溶液透析，4℃过夜。用透析过夜的pPICZαA-Lys-C酶切门冬胰岛素前体，RP-HPLC法检测其酶切活性。

2 结果与讨论

2.1 pPICZαA-Lys-C/Top10F’重组质粒的构建鉴定结果

利用重组子上带有的博莱霉素抗性基因进行筛选。比较pPICZαA-Lys-C与阴性对照平板上单菌落个数，如果阴性对照平板生长的菌落较多，说明载体酶切不完全，则要重新酶切、连接。若pPICZαA-Lys-C平板上菌落明显多于阴性对照平板单克隆，则可进行下一步阳性克隆筛选。

pPICZαA-Lys-C平板长出100多个菌落，阴性对照平板仅长出少于10个菌落，说明载体酶切完全。重组质粒PPICZαA-Lys-C大肠杆菌转化结果见图1，其中左边为阴性对照，右边为pPICZαALys-C/Top10F’转化平板。

图1 pPICZαA-Lys-C重组质粒转化Top10F’阴性阳性对比

挑取pPICZαA-Lys-C转化子接种于5 mL LBZeocin液体培养基中，37℃、150 r/min培养过夜，将培养过夜菌体提取质粒并利用Xho I、Not I进行双酶切。将反应体系混匀放置于37℃恒温箱1 h，酶切产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图2所示，菌落质粒双酶切后分别形成3600 bp左右和1930 bp左右两个线性片段，分别对应于pPICZαA片段和Lys-C片段，表明上述质粒已重组了pPICZαA-Lys-C目的片段。

2.2 SDS-PAGE电泳法检测重组赖氨酸内肽酶表达结果

①Marker

② X-33诱导表达上清1 mL+10 μL Wako酶

③ pPICZαA-Lys-C/X-33诱导表达上清1 mL

④ X-33 BMGY上清1 mL+10 μL Wako酶

⑤ pPICZαA-Lys-C/X-33 BMGY上清1 mL

⑥ 4 μL Wako 酶 +8 μL DDW+4 μL 还原上样Buffer

⑦ 4 μL Wako 酶 +8 μL DDW+4 μL 非还原上样Buffer

进行TCA处理后，电泳检测，结果见图3。

图2 pPICZαA-Lys-C/Top10F’单菌落抽提质粒双酶切鉴定图

图3 SDS-PAGE法检测表达量结果

如图3所示，Wako酶在还原与非还原条件下均呈主带分子量为26 kDa的目的条带，与文献报道结果一致［14-15］，即常规电泳检测条件可准确分析Wako公司Lys-C蛋白酶;将Lys-C蛋白酶还原至BMGY培养基上清，在还原条件下，主带仍清晰可见，且其条带粗细与还原前相似，即BMGY培养基上清未影响Lys-C蛋白酶电泳检测;pPICZαALys-C/X-33表达菌诱导48 h上清液在Lys-C目的条带处均未见明显蛋白条带，表明上述两重组菌诱导48 h仍未产生明显表达Lys-C蛋白酶。但pPICZαA-Lys-C/X-33表达菌诱导48 h上清液在44 kDa和80 kDa左右处有明显蛋白条带，可能为相关蛋白，可通过免疫斑点进一步验证。

2.3 免疫斑点法鉴定重组赖氨酸内肽酶表达结果

检测结果见图4，其中:

第1排1～8号分别为:Wako酶100 μg/mL、10 mg/mL、1 μg/mL、100 ng/mL、Lys-C 硫酸铵沉淀上清+20 μL Wako酶、Lys-C硫酸铵沉淀上清+100 μL Wako 酶、稀释液、100 μg/mL Trypsin。

第2排1～8号分别为:pPICZαA-Lys-C-1(未稀释)、pPIC9K-ZαA-C-1(稀释 10 倍)、pPICZαALys-C-2(未稀释)、pPICZαA-Lys-C-2(稀释10 倍)、pPICZαA-Lys-C-3(未稀释)、pPICZαA-Lys-C-3(稀释10 倍)、pPICZαA-Lys-C-4(未稀释)、pPICZαALys-C-4(稀释10倍)。

第3排 1～6号分别为:GS115、X-33、X-33+Wako酶、GS115+Wako 酶、pPICZαA-RL2、pPIC9KHVGL。

图4 免疫斑点法检测结果

由图4中免疫斑点结果可知:阳性对照Wako酶正常显色，诱导表达上清硫酸铵沉淀回收补加20 μL 和100 μL 的 Wako 酶均显色，且补加100 μL的Wako酶比20 μL的 Wako酶显色较深，非相关酶 100 μg/mL Trypsin 未显色;pPICZαALys-C-3(未稀释)显色并颜色较深，可以判断pPICZαA-Lys-C-3为重组赖氨酸内肽酶有表达菌株;GS115未显色，X-33轻微显色，GS115+Wako酶和X-33+Wako酶均显色，非相关物质诱导表达上清pPICZαA-RL2、pPIC9K-HVGL硫酸铵沉淀样品均为显色。

免疫斑点法结果分析后可以得知，Wako酶还原到硫酸铵沉淀法中依然可以检测到其活性，说明硫酸铵沉淀法对此实验结果无影响，非相关酶以及非相关物质对免疫斑点结果亦无影响，pPICZαA-Lys-C-3为有活性表达的菌株，可将其保存并进行下一步RP-HPLC法酶切活性鉴定试验。

2.4 RP-HPLC法鉴定重组赖氨酸内肽酶酶切活性结果

实验样品:将pPICZαA-Lys-C表达上清样品用硫酸铵沉淀法沉淀，后用1 mL 50mMTris溶解，DDW透析过夜，得到样品;酶切底物为门冬胰岛素前体(PI-Asp、2 mg/mL)。实验组设置:① PIASP+硫酸铵沉淀法沉淀的pPICZαA-Lys-C/X-33诱导表达上清;②PI-ASP未酶切样品;③ PI－ASP+Wako酶(用50 mM Tris pH值8.7稀释250倍)。

上述实验组①～③按体积比1∶20与2.0 mg/mL门冬胰岛素前体混合(即Lys-C蛋白酶与门冬胰岛素前体酶切比例为1∶10000)，37℃酶切过夜处理，RP-HPLC检测。门冬胰岛素前体浓度:2 mg/mL;Wako酶浓度:1 mg/mL。检测结果见图5。

图5 RP-HPLC法检测酶切活性结果

由图5可见:在50 mM Tris pH值8.7的条件下，Wako公司Lys-C蛋白酶可对门冬胰岛素前体进行较好的酶切;门冬胰岛素前体出峰时间为12.264 min，门冬胰岛素出峰时间为13.533 min;pPICZαA-Lys-C/X-33表达菌诱导 48 h上清液1∶20与门冬胰岛素前体混合后，门冬胰岛素前体峰未见明显降低，且其图谱与PI-ASP未酶切样品无明显差异，表明上述重组菌诱导48 h仍未产生明显有活性的Lys-C蛋白酶。

3 结束语

在本实验中，经过核酸蛋白电泳、SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳法)和免疫斑点法检测结果表示，重组的赖氨酸内肽酶在结构和表达上都能重现赖氨酸内肽酶的特性，然而在RP-HPLC酶切活性法检测中，重组菌诱导的48 h后的 Lys-C不能完整地酶切门冬胰岛素前体，说明重组赖氨酸内肽酶的活性不稳定。在后续的实验中方案，可以适当延长诱导时间，分别取不同时间点的诱导上清进行酶活性检测。同时也可使用蛋白纯化方法对重组菌诱导上清进行纯化，以提高其活性，使重组赖氨酸内肽酶能够更好地应用于胰岛素的制备工艺中，并与天然的赖氨酸内肽酶相比具有相同的酶切作用。

［1］King H，Aubert R E，Herman W H.Global burden of diabetes，1995-2025:prevalence，numerical estimates，and projections［J］.Diabetes Care，1998，21(9):1414－1431.

［2］骆天红，陈家伦.胰岛素原的基础和临床研究［J］.国外医学内分泌学分册，1996，15(2):57-60.

［3］冯佑铭，张友尚.重组人胰岛素研究的回顾和展望［J］.生物工程进展，1996，16(4):27-31.

［4］Kemmler W，Peterson J D，Steiner D F.Studies on the Conversion of proinsulin to insulin.I.Conversion in vitro with trypsin and Carboxy peptidase B［J］.J Biol Chem，1971，246(22):6786-6791.

［5］Philip A K，Rongji Chen，Alcantara J，et al.Rapid Purification of Lys-C from Lysobacter enzymogenes Cultures［J］.BioProcess International，2009，28.

［6］Ohara S T，Makinoe K，Shinagawag H，et al.Cloning，Nucleotide Sequence，and Expression of Achromobacter Protease I Gene* ［J］.The Journal of Biological Chemistry，1989，264(34):20625-20631.

［7］赵翔，霍克克，李育阳.毕赤酵母密码子用法分析［J］.生物工程学报，2000，16(3):308-311.

［8］李明才，何韶衡.一种高效、快速的大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法［J］.汕头大学医学院学报，2005，18(4):228-230.

［9］Ludovic O.Molecular Cloning of the cDNA encoding laeease from Pycnoporus Cinnabarinus and expression in Pichiapastoris［J］.Eu-rJ Bio Chem，2000，26(7):1619-1625.

［10］张艳，杨清武，吕凤林.毕赤酵母高效电转化方法的探讨［J］.中国修复重建外科杂志，2002，16(3):217.

［11］韩冬，徐煌，孔宁，等.人HER2/neu胞外区在毕赤酵母中的表达及鉴定［J］.中国老年学杂志，2008，28(7):631-633.

［12］高剑坤.一种新型长效人胰岛素类似物的研制［D］.重庆:重庆大学，2007.

［13］左祖英，张风鸣，肖影，等.一种简易的免疫斑点试验［J］.川北医学院学报，1995(4):73-73.

［14］Chohnan S，Nonaka J，Teramoto K.Lysobacter strain with high lysyl endopeptidase production［J］.FEMS Microbiology Letters，2002，213:13-20.

［15］Tsunasawa S，Masaki T，Hirose M.The Primary Structure and Structural Characteristics of Achromobacter lyticus Protease I，a Lysine-specific Serine Protease［J］.The Journal of Biological Chemistry，1989，264(7):3832-3839.