纳米纤维支架对人肌腱成纤维细胞的生长及相关基因表达的影响

王威 廖苏平 危蕾 吴波 刘俊

·实验研究论著·

纳米纤维支架对人肌腱成纤维细胞的生长及相关基因表达的影响

王威 廖苏平 危蕾 吴波 刘俊

目的 研究人肌腱成纤维细胞(tendon derived fibroblasts, TDFs)在聚乳酸(poly-L-lactic acid, PLLA)纳米纤维支架及聚乳酸/Ⅰ型胶原蛋白(PLLA/Col-Ⅰ)纳米纤维支架上的生长情况及相关基因的表达情况。方法 将TDFs分别种植于空白盖玻片(空白组)、载有PLLA纳米纤维支架的盖玻片(PLLA组)和载有PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维支架的盖玻片上(PLLA/Col-Ⅰ组)，观察细胞生长情况，并检测Ⅰ、Ⅲ、Ⅹ型胶原蛋白(Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅹ)以及整合素相关基因黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的基因表达情况。结果 PLLA组细胞生长速度低于空白组和PLLA/Col-Ⅰ组，而PLLA/Col-Ⅰ组和空白组相比，细胞生长速度差异无统计学意义。和PLLA组及空白组相比，PLLA/Col-Ⅰ组中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅹ以及FAK基因表达水平显著升高，PLLA组和空白组无明显区别。结论 PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维支架对TDFs的生长有促进作用，且有利于Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅹ及FAK基因的表达，能为肌腱修复提供一种理想的组织工程支架材料。

肌腱；成纤维细胞；纳米纤维；聚乳酸；Ⅰ型胶原蛋白

肌腱缺损是临床常见的疾患之一，未能及时予以修复常会导致机体功能障碍，甚至残废。因而对缺损肌腱的修复和重建是临床重要的研究课题之一。目前临床上常行自体肌腱移植修复、同种异体肌腱移植或异种肌腱移植治疗等，然而由于供体肌腱缺乏、免疫排斥等原因往往限制了其治疗效果[1，2]。随着细胞培养和移植技术的发展，以及生物材料学的进步，组织工程化人工肌腱成为研究热点之一，并有望最终解决肌腱缺损问题[3]。

理想的肌腱修复支架需要满足以下条件：①与肌腱细胞相容；②有利于细胞的迁徙和增殖；③在愈合过程中，能够促进细胞外基质的形成。基于电子纺丝制备的纳米纤维支架具有许多优点：与人类的细胞外基质形态相似，具有非常细微的连续性的纤维，高表面积与容量比，多孔性等。这些性能可促使细胞在支架上黏附、增殖并促进营养物、废物的运输等[4]。与其他支架制备技术相比，电纺技术高效快速、设备简单、操作容易，便于控制化学组分和物理性能[5]，且能通过许多聚合物制造出来，如多聚甘醇酸、聚乳酸(poly-L-lactic acid, PLLA)、胶原蛋白、聚氨基葡萄糖等[6]，具有生物相容性及可降解性。

有研究显示电子纺丝制备的含有PLLA/Ⅰ型胶原(PLLA/Col-Ⅰ)的纳米纤维是适合骨缺损的移植修复物，能促进干细胞的骨形成分化和生长[7]。而关于其对人肌腱成纤维细胞(tendon derived fibroblasts, TDFs)的生长和相关基因表达的影响鲜见报道。本研究通过试验重点观察纳米纤维支架对TDFs的生长和相关基因表达的影响，并对PLLA纳米纤维支架和PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维支架进行比较。

材料与方法

一、PLLA纳米纤维支架的制备

以六氟异丙醇为溶剂，在室温下与PLLA溶液(Mw=1.0×105，Tg=57.9 ℃，深圳光华伟业实业有限公司)混合并持续搅拌3 d，最终得到重容比为4.5%的溶液。将制备好的溶液装入毛细微管后置入高静电场制备纳米纤维支架。电纺条件：流速为14 μL/min，外加电压18 kV，接收装置距离为15 cm。PLLA纳米纤维收集在19 mm盖玻片上。将制备好的PLLA纳米纤维支架放入通风橱中干燥过夜备用。

二、PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维支架的制备

将Col-Ⅰ与PLLA溶液按4∶1的比例温和搅拌制成PLLA/Col-Ⅰ混合溶液，再按上述步骤电纺制备出PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维支架备用。

三、TDFs的分离及培养

肌腱来源于手术中废弃的肌腱组织，以生理盐水反复冲洗3遍，再以0.25%氯霉素溶液浸泡30 min，之后去除肌腱组织的腱鞘膜，剪成2 mm3左右的小块，在37 ℃下使用胶原酶消化30 min。去掉胶原酶，使用PBS漂洗，随后种植于含有10%小牛血清及1%青链霉素的DMEM培养皿上，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。1周后，当细胞从肌腱上迁徙并附着于培养皿上以后，去除肌腱块，贴壁的细胞进行下一步的培养。

TDFs按3×104个/cm2的密度种植于三组盖玻片上：空白组，为空白盖玻片；PLLA组，盖玻片上覆盖含PLLA的纳米纤维；PLLA/Col-Ⅰ组，盖玻片上覆盖含PLLA/Col-Ⅰ的纳米纤维。将各组培养在含低糖、低谷氨酸以及10%小牛血清的DMEM培养基中。隔日更换1次培养液。

四、细胞免疫荧光染色

细胞培养5 d后，取出盖玻片用PBS进行漂洗，然后使用浓度为5 μg/mL 的二乙酸荧光素(fluorescein diacetate, FDA)进行染色。使用莱卡DM5000荧光显微镜进行观察，并用高倍显微摄像。利用Quips分析软件进行分析。

五、检测相关基因的表达

主要检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅹ、β-肌动蛋白(β-actin)、整合素相关基因黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)等基因的表达情况。

1.逆转录过程 分别在培养的第5、10、20天采用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法提取总RNA。使用逆转录试剂盒(Boehringer mannheim产品)合成cDNA，20 μL反应体系主要包括：反应缓冲液、10 mmol/L dNTP、1 μg 总RNA、50 U RNase inhibitor、50 U AMV逆转录酶、1.6 μg oligo-dT，于42 ℃反应30 min，99 ℃下5 min，终止反应。

2.PCR扩增 建立100 μL的反应体系，主要成分如下：反应缓冲液、10 mmol/L dNTP、引物(见表1，同时选用β-actin作内参)、2～3 μL cDNA产物、5 U Taq DNA聚合酶。95 ℃下10 min预变性，反应40个循环，每循环94 ℃、60 ℃、72 ℃各1 min，最后1个循环72 ℃保持10 min。

目标基因的分析使用Delta-delta Ct以及Cyber Green。

表1 RT-PCR扩增中使用的引物序列

六、统计学分析

结 果

一、细胞免疫荧光染色

通过荧光染色观察，空白组与PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维组细胞密度差别不大，而PLLA纳米纤维组细胞密度显著降低(图1a～c)。应用统计学软件分析各组中FDA阳性细胞占比，空白组与PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维组相比，差异无统计学意义；而PLLA纳米纤维组细胞密度与空白组及PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维组相比显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

二、对胶原蛋白基因表达的影响

在细胞培养的第5、10、20天，检测Col-Ⅰ基因表达情况。如图3所示各个时间点，PLLA纳米纤维组中Col-Ⅰ基因的表达与空白组没有明显差异。而PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维组中Col-Ⅰ基因的表达与空白组和PLLA纳米纤维组两组相比明显增高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组中Col-Ⅰ基因的表达均在第10天达到高峰。

在肌腱修复中，Col-Ⅲ和Col-Ⅹ同样重要。结果显示空白组、PLLA纳米纤维组两组中各个时间点上Col-Ⅲ基因的表达均无明显差异。PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维组与空白组、PLLA纳米纤维组相比，在第5天时差异无统计学意义，但是在第10天和第20天时，PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维组中Col-Ⅲ基因的表达明显高于空白组和PLLA纳米纤维组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，且后期Col-Ⅲ在PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维组中的表达呈增长趋势，见图4。

Col-Ⅹ基因的表达与Col-Ⅰ相似，空白组与PLLA纳米纤维组相比差异无统计学意义，第5、10天时PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维组中Col-Ⅹ基因的表达均高于其他两组，差异均有统计学意义(均P<0.05)，而且各组中Col-Ⅹ基因的表达高峰均在第10天，见图5。

三、对FAK基因表达的影响

本研究显示各个时间点FAK的基因表达在PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维组中的表达均比空白组和PLLA纳米纤维组中显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图6。

图1 TDFs培养5 d时免疫荧光染色结果(×100) a：空白组；b：PLLA纳米纤维组；c：PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维组

图2 各组FDA阳性细胞占比统计图

图3 各组中Col-Ⅰ基因的表达情况

图4 各组中Col-Ⅲ基因的表达情况

图5 各组中Col-Ⅹ基因的表达情况

图6 各组中FAK基因的表达情况

讨 论

PLLA是一种可生物降解的热塑性脂肪族聚酯，主要原料乳酸又是可再生资源，无毒副作用，具有良好的生物相容性，可塑性好，有着广泛的研究和应用前景，被认为是最有前途的生物医用材料和新型包装材料之一[8]。Col-Ⅰ是一组由多种糖蛋白组成的大家族，不仅具有合成高分子不可比拟的生物相容性、降解性和低抗原性，而且具有一系列重要的生物学功能，因其可转化为生物医学材料，渐渐引起人们的关注[9，10]。

组织工程支架是组织工程研究的重要组成部分，支架所形成的三维结构不但为细胞获取营养、生长和代谢提供了一个有利的空间，也为植入的细胞分泌细胞外基质最终形成相应的组织或器官提供了一个良好的环境。静电纺丝技术是制备组织工程支架材料最有效的方法之一[11]。

以PLLA为原料制备的纳米纤维支架已广泛应用于组织工程中骨和软骨组织的构建和再生，通过在材料上培养组织细胞，并逐渐生长成组织和器官。目前对包括软骨、皮肤、神经和血管等培养的研究己经取得可喜的进展[12-14]。而关于TDFs在PLLA纳米纤维支架上的生长能力和基因表达情况，以及联合应用PLLA和Col-Ⅰ制备纳米纤维支架的研究却鲜见报道。

本研究发现，与玻璃表面相比，PLLA纳米纤维支架培养的细胞数目显著下降，提示PLLA纳米纤维可能影响TDFs的增殖。具体原因可能是PLLA纳米纤维支架结构不利于TDFs细胞生长。亦有研究利用PLLA纳米纤维培养人骨髓间充质干细胞，观察到与玻璃表面相比，Ki67单抗细胞阳性率降低[15]。

还有研究发现PLLA纳米纤维对细胞密度的这种抑制作用会在PLLA中加入Col-Ⅰ后抵消，这提示胶原蛋白能够抵消PLLA对细胞增殖的抑制作用。

细胞外基质的形成对于肌腱的修复及生长具有重要作用。Col-Ⅰ是肌腱的重要成分，并且与肌腱的抗拉强度密切相关[16]。因此，理想的支架应该能够利于Col-Ⅰ的生长。培养在PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维上的TDFs数量及Col-Ⅰ的基因表达都得到了增长，而在PLLA纳米纤维中却没有这样的效果。除了Col-Ⅰ，Col-Ⅲ和Col-Ⅹ等细胞外基质成分与肌腱修复也密切相关[17]。本研究显示同PLLA纳米纤维组及空白组相比，在PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维中，Col-Ⅲ和Col-Ⅹ的表达均明显升高。

整合素为亲异性细胞黏附分子，介导细胞与细胞间、细胞与胞外基质间的相互作用，以及胞内信号和胞外信号的相互通讯。黏着斑是连接胞内和胞外环境的重要信号分子复合物，其中最重要的是FAK。FAK是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，它可通过整合细胞外信号和介导细胞内的一系列生化反应来调节下游分子的活性，参与生长发育、细胞增殖、迁移、存活、凋亡等过程[18，19]，其表达的增强与肌腱和韧带的愈合有关[20，21]。本研究中FAK在PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维中的表达较空白组及PLLA纳米纤维组中有所升高。

综上所述，本研究提示PLLA/Col-Ⅰ纳米纤维支架对人肌腱成纤维细胞生长有促进作用，且有利于Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Col-Ⅹ基因以及整合素信号通路FAK基因的表达，能为组织工程技术进行肌腱修复提供一种理想的支架材料。

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Influence of PLLA/Col-Ⅰ nanofibers on growth of human tendon-derived fibroblast and the gene expression.

WANGWei,LIAOSuping,WEILei,WUBo,LIUJun.

DepartmentofOrthopaedics,Pu’aiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430033,China

Objective To explore the effects of PLLA nanofibers and PLLA/Col-Ⅰ nanofibers on human tendon-derived fibroblasts (TDFs), and the related gene expression.Methods TDFs were respectively cultured on the cover slip (blank group), PLLA nanofibers (PLLA group) and PLLA/Col-Ⅰ nanofibers (PLLA/Col-Ⅰ group).The growth of TDFs, and the gene expression of collagensⅠ, Ⅲ, Ⅹ and FAK during the course of culture were analyzed.Results The growth of TDFs in PLLA group was significantly inhibited as compared with blank group and PLLA/Col-Ⅰ group.The gene expression of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ and collagen Ⅹ, and FAK was remarkably up-regulated in PLLA/Col-Ⅰ group as compared with PLLA group and blank group, but there was no significant difference between PLLA group and blank group.Conclusion This study indicates that PLLA/Col-Ⅰ nanofibers can promote the growth of TDFs, and can enhance the gene expression of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ and collagen Ⅹ remarkably, as well as the gene expression of FAK.PLLA/Col-Ⅰ nanofibers may be an ideal scaffold of tissue engineering technology in the repair of tendon.

Tendon; Fibroblast; Nanofibers; Poly-L-lactic acid; Collagen Ⅰ

10.3969/j.issn.1674-8573.2015.01.001

武汉市卫计委临床医学科研项目(No.WX11C20)

430033 武汉，华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科

王威，E-mail：orthww@163.com

2014-08-06