线粒体DNA突变与遗传性耳聋

张雪溪张杰陈敏郝津生杨扬张亚梅

1首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科

儿童耳鼻咽喉头颈外科疾病北京市重点实验室（北京，100045）

线粒体DNA突变与遗传性耳聋

张雪溪1张杰1陈敏1郝津生1杨扬1张亚梅1

1首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科

儿童耳鼻咽喉头颈外科疾病北京市重点实验室（北京，100045）

1　概述

遗传性耳聋是指由于人类个体基因（包括核基因及线粒体基因）异常所致的耳聋。它可以分为非综合征型遗传性耳聋（non-syndromic hearing impair⁃ment）和综合征型遗传性耳聋（syndromic hearing im⁃pairment）两大类。综合征型遗传性耳聋通常为染色体结构或功能异常引起的一类同时伴有多种其他临床表现或疾病的耳聋，这类患者约占遗传性耳聋的30%。非综合征型遗传性耳聋患者耳聋为其特异性症状，一般不伴有其他临床表现或疾病，约占遗传性耳聋的70%。根据遗传方式的不同，可以将非综合征型遗传性聋分为如下四种：常染色体显性遗传（DFNA）、常染色体隐性遗传（DFNB）、性染色体连锁（X连锁隐性遗传DFNX和Y-连锁遗传DFNY）以及线粒体突变母系遗传。[1]在这四种非综合征型遗传性耳聋中，因线粒体DNA突变率高，检测手段复杂，故线粒体突变母系遗传的研究较少。本文探讨线粒体DNA突变导致耳聋的机制。

线粒体是体细胞内进行有氧呼吸的场所，也是调控细胞凋亡重要的细胞器，它广泛存在于真核细胞内。线粒体DNA，是唯一独立于体细胞核染色体的基因组，它具有自我复制、转录及编码功能。人类线粒体DNA为双链闭合环状超螺旋DNA分子，Anderson[2]等测定人线粒体DNA分子全长16569个碱基，其中有37个已知基因，分别编码核糖体12s rRNA、核糖体16s rRNA、22种转录tRNA和13种信使mRNA。

线粒体DNA因为缺乏组蛋白的保护，自然突变率约为核基因组的10-20倍。但是，其中绝大多数突变为无义突变，仅有少部分累及线粒体基因进化上高度保守区域的突变会引起线粒体疾病的发生[3]。文献报道，人线粒体疾病的发生率约为1/6500[1]。截止目前，已发现超过520个致病的线粒体基因突变。

2　线粒体基因突变的致聋机制

本文根据线粒体基因编码的RNA类型，探讨不同线粒体基因突变与遗传性耳聋的深层次关系。

2.1核糖体12s rRNA突变与遗传性耳聋

线粒体DNA 1555 A＞G突变[4]是最早发现的线粒体突变母系遗传性耳聋基因。该突变位点位于线粒体核糖体小亚基（12s rRNA）的氨基酸结合位（A位），且从细菌到哺乳动物高度保守。此突变区域所对应的大肠杆菌（E.coli）16s rRNA基因的同源区域，是细菌核糖体解码区不可缺少的部分。并且，它对于RNA-蛋白质或RNA-RNA相互识别及连接的亚基组装也起着关键的作用。同时，该区域也是氨基糖甙类抗生素（AmAn）抗菌的作用位点：链霉素、庆大霉素、巴龙霉素、新霉素等氨基糖甙类抗生素均是与细菌16s rRNA氨基酸结合位（A位）的C1409-G1491碱基对相互作用，产生对野生型大肠杆菌（E.coliwild type）的抗菌作用。人类野生型线粒体12s rRNA 1555位点（对应于大肠杆菌16s rRNA的1491位点）的核苷酸碱基为腺嘌呤（A），在突变家系中，该碱基突变为鸟嘌呤（G），它与1494位点的碱基胞嘧啶（C）形成新的配对。这一改变使得线粒体12s rRNA的二级结构与大肠杆菌16s rRNA的对应区域更加相似。因此，线粒体12s rRNA基因突变形成的新碱基配对更利于其结合氨基糖甙类抗生素，导致抗生素性耳聋。随后，世界范围内发现了很多携带线粒体DNA 1555 A＞G突变的耳聋家系，包括亚洲人、欧洲人、高加索人以及非洲人等，同时也有散发个体的报道[5-11]。有研究发现[10]，即使没有药物作用，线粒体DNA 1555A＞G突变仍可导致耳聋的发生。

为了寻找线粒体12s rRNA基因上导致遗传性耳聋的其他突变位点，Lu等[12]对两个中国耳聋人群进行了系统而广泛的突变筛查，发现了线粒体12s rRNA基因上一个新的突变位点：线粒体DNA 1494 C＞T突变。在该突变家系中，没有氨基糖甙类抗生素用药史的母系成员也可表现出迟发性或渐进性耳聋，而使用氨基糖甙类抗生素则可以诱发或加重该母系成员的耳聋表型[13]。线粒体DNA 1494C＞T突变与1555位点形成的新碱基对U1494-1555A与线粒体DNA1555A＞G突变形成的碱基对C1494-1555G位置相同，均位于线粒体12s rRNA高度保守的氨基酸结合位（A位），因此导致了氨基糖甙类抗生素致聋的发生。

研究发现[11]，在中国和高加索的遗传性耳聋人群存在线粒体DNA 1095T＞C突变。在这两个不同遗传背景的耳聋人群同时发现线粒体DNA 1095T＞C，提示该突变是遗传性耳聋的可能原因。线粒体DNA1095 T＞C突变破坏了线粒体12s rRNA第25螺旋颈环处进化上非常保守的碱基对。同时，该核苷酸位于核糖体的蛋白质结合位（P位），提示其在线粒体蛋白合成起始阶段的重要性。在不同遗传背景的遗传性耳聋家系和散发性人群中，还发现了与耳聋相关的线粒体DNA 961位点突变，其突变形式有：在高加索和亚洲人群中发现的线粒体DNA ET961Cn突变和线粒体DNA961-C插入突变；在高加索人群中发现的线粒体DNA961 T＞G突变以及在中国人群中发现的线粒体DNA961 T＞C突变[12-14]。线粒体DNA 961位点位于线粒体12s rRNA第21、22环之间的C碱基簇，这一区域在进化上并不是很保守，其功能也不是很明确，特别是细菌的同源区域与氨基糖甙类抗生素的相互作用机制还有待进一步研究[15]。

此外，通过对中国儿童聋病人群线粒体12s rRNA基因序列的分析以及临床和遗传资料的评估，发现了12个可能与氨基糖甙类抗生素耳毒性或遗传性耳聋相关的变异位点，包括线粒体DNA 745A＞G、792C＞T、801 A＞G、839 A＞G、856 A＞G、1027 A＞G、1192 C＞T、1192 C＞A、1310 C＞T、1331 A＞G、1374 A＞G和1452 T＞C等。这些变异位点都位于线粒体12s rRNA高度保守的核苷酸上，且不存在于449个正常对照者中。[15]其他已报道的与耳毒性相关的变异位点还包括：线粒体DNA 990T＞C和1537C＞T等[12]。

2.2转运tRNA突变与遗传性耳聋

人类线粒体DNA共编码22个转运tRNA基因，散布于多肽和核糖体rRNA基因之间。其中，谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、天冬酰胺（Asn）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、丝氨酸（Ser）（编码为UCN）、谷氨酰胺（Gln）和脯氨酸（Pro）由轻（L）链编码；其余14个由重（H）链编码，分别是苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）（编码为UUR）、亮氨酸（Leu）（编码为CUN）、异亮氨酸（Ile）、甲硫氨酸（Met）、丝氨酸（Ser）（编码为AGY）、色氨酸（Trp）、天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His）和苏氨酸（Thr）。与胞质tRNA一样，线粒体tRNA也存在转录后修饰，修饰的核苷酸对于tRNA结构功能的稳定非常重要。但与经典细菌tRNA、胞质tRNA不同，线粒体tRNA含有较多的G-U配对和错配，这些U-G配对和错配在进化上高度保守，或参与高级结构的形成，对于维持tRNA稳定性和特异性具有重要意义。

线粒体tRNA为蛋白质合成的重要工具，在遗传进化过程中高度保守，tRNA异常通常导致遗传性疾病的出现。其与综合征性耳聋相关的是位于tRNALeu（UUR）基因上的3243 A＞G突变，该基因突变发生于核糖体16s rRNA与转运tRNA交界处，改变了tRNALeu（UUR）的双氢尿苷环（DHU环）的稳定性。这导致了母系遗传性糖尿病耳聋综合征（maternally inherited diabetes and deafness，MIDD）或线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及卒中样发作综合征(mitochondrial encephalomyopathy，lacticacidosis，and stroke-like ep⁃isodes，MELAS)的发生。[13]而与非综合征型耳聋相关的突变有：tRNAHis12201T＞C，tRNAIle4295A＞G、tRNASer（UCN）7445 A＞G、7505 T＞C、7510 T＞C以及7511 T＞C突变[14]。。这些突变影响了tRNA前体的加工，核酸修饰和氨酰化，从而改变了tRNA的结构及功能。

目前，己报道40余种致聋的线粒体tRNA基因。这些线粒体tRNA突变分为原发性突变和继发性突变。原发性突变是指单一的线粒体DNA突变即可引起耳聋症状，其临床表型及严重程度因突变位点不同而异。继发性突变是指突变本身不足以引起耳聋症状，但其对原发突变的耳聋表型表达有正义/反义修饰作用。临床上观察到，在部分携带原发性线粒体DNA突变的家系中，并非所有母系成员都会出现耳聋症状，即使携带相同线粒体DNA突变的患者在发病年龄、发病过程以及听力损伤程度等方面也存在明显差异。这是因为线粒体tRNA继发突变对耳聋相关的原发性线粒体DNA突变起协同或拮抗作用，调节原发性tRNA突变的表型表达。目前已知的tRNA突变引起耳聋如下表1[14]

表1

其中，tRNASer（UCN）突变是目前致聋机制较为明确的突变。Reid[16]等最早在一个渐进性听力下降的苏格兰家系中发现了线粒体tRNASer（UCN）7445A＞G突变。后续研究又发现了其他tRNASer（UCN）突变的存在，包括：线粒体tRNASer（UCN）线粒体tRNASer(UCN)7445 A＞G、7444G＞A突变[15、17]均造成线粒体DNA重链编码的线粒体细胞色素C酶Ⅰ（COⅠ）基因的终止密码子AGA变成AGG，使得线粒体细胞色素C酶Ⅰ（COⅠ）多肽末端增加了3个氨基酸（Lys-Gln-Lys）。同时，该突变邻近轻链上tRNASer（UCN）3'端核酸内切酶的剪切位点，影响了tRNASer（UCN）前体加工，造成线粒体tRNASer（UCN）稳定性显著下降，导致线粒体功能障碍。同时有研究表明，线粒体DNA 7444G＞A突变可加重由原发性线粒体DNA 1555 A＞G突变造成的线粒体功能缺陷，从而影响该突变的表型表达[18]。

而线粒体tRNASer(UCN)7511T＞C、7510T＞C突变[17、18]，造成氨基酸受体臂上的高度保守区的结构变化。前者导致的A-U碱基不配对，而后者导致胸腺嘧啶（T）至胞嘧啶（C）的变化，进而影响线粒体RNaseP作用的tRNASer(UCN)前体加工、从而影响它与对应氨基酸的识别结合，造成蛋白表达水平下降。在一个携带tRNASer(UCN)7511 T＞C突变的耳聋家系中，母系成员的线粒体DNA还同时携带呼吸链复合体Ⅰ（NDⅠ）3308T＞C突变和tRNAAla5655 T＞C突变。这2个突变加重了原发线粒体tRNASer(UCN)7511 T＞C突变引起的线粒体蛋白合成障碍，使得该家系耳聋外显率极高。这个结果提示我们：线粒体多基因突变会产生协同作用，引起更多见、更严重的耳聋。

最近研究发现的tRNASer(UCN)7505 T＞C、7462C＞T突变，分别导致tRNASer(UCN)双氢二尿茎上10A-20U碱基配对消失、双氢二尿环结构缺失。这些结构异常，导致蛋白质表达水平下降，引起线粒体功能异常，进而导致耳聋的发生。

在一个线粒体DNA 1555 A＞G突变且耳聋外显率极高的中国大家系中，发现了线粒体tRNAThr15927G＞A突变[19]。该继发突变位于tRNAThr反密码子臂上的第4个碱基（42位），从细菌到哺乳动物都是高度保守的，发生突变后造tRNAThr（28C-42G）碱基不配对，从而可能影响tRNA的正常结构。同时携带tRNAThr15927G＞A和线粒体DNA 1555 A＞G突变的融合细胞中tRNAThr的稳态水平要远低于只携带线粒体DNA 1555 A＞G突变的细胞。该突变可能导致tRNAThr高级结构发生改变，从而影响tRNA的稳定性。因此，tRNAThr15927G＞A突变可能加重由线粒体DNA 1555 A＞G突变造成的线粒体功能障碍，增加耳聋的外显率。这一结果再次证明线粒体多基因突变的协同作用，但是其机理尚须继续探索。

耳聋相关的线粒体tRNA突变可能影响tRNA的高级结构、转录及转录后的加工修饰过程，造成tRNA稳定性下降，进而抑制线粒体蛋白质合成。另外，一些修饰因子与tRNA原发突变同时存在时，可进一步加重线粒体功能障碍，使得线粒体产生ATP能力下降，使能量需求旺盛的组织出现障碍。同时，关于线粒体tRNA致聋的机制目前仍不明确。例如：非综合征型耳聋相关的转运tRNA突变具有典型的组织特异性，tRNA上某些功能性碱基只在耳蜗组织中被化学修饰。这可能是该类tRNA突变导致特应性组织病变的深层次原因。其次，综合征型耳聋及部分非综合征型耳聋相关的线粒体tRNA突变为异质性，也就是说突变型线粒体DNA数量达到一定阈值，才会表现出临床症状，阈值的确定对于线粒体疾病的诊断、治疗具有重要意义，但目前还没有建立有效的方法来界定线粒体DNA突变的阈值等。

2.3核糖体16s rRNA突变与遗传性耳聋

袁慧君等[20]曾报道了16s rRNA基因2227位AA插入突变，但突变导致16s rRNA结构改变以及具体致聋机理尚在研究中。

2.4信使RNA与遗传性耳聋

上文曾经阐述了线粒体tRNASer(UCN)7445 A＞G、7444G＞A突变引起线粒体DNA重链编码的线粒体细胞色素C酶Ⅰ（COⅠ）基因的终止密码子改变而引起耳聋的机理。目前其他致聋的mRNA仍在研究中。

3　人类线粒体病的干细胞基因治疗

以往观点认为，线粒体母系遗传疾病无法得到基因层面的根本性治疗。目前临床上采用对症治疗，如对线粒体DNA 12s rRNA 1555 A＞G突变患者终生禁用氨基糖甙类药物等方法。

Hong等[21]应用细胞核移植技术为线粒体缺陷性疾病提供了新的治疗前景。研究人员将线粒体基因缺陷患者的皮肤细胞的细胞核移植到健康捐献者的卵子细胞外壳细胞浆内（去掉细胞核的细胞），利用这种技术，科学家制造出拥有健康人线粒体的患者自身的胚胎干细胞。研究人员选取了线粒体DNA3243A→G突变，以及线粒体DNA 8993T>G和13513G>A突变患者的体细胞，通过细胞核移植制备成健康的患者诱导干细胞。研究结果证实，这些患者诱导干细胞代谢功能可以被纠正。

随着人类科学水平的进步，我们有望更好的认识并治疗线粒体相关遗传性耳聋这类疾病。

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R394.112

A

1672-2922（2015）03-454-04

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.03.016

张雪溪，硕士，住院医师，研究方向：儿童耳鼻咽喉科学

张杰，Email:stzhangj@263.net

2015-8-26)