自噬在镉致大鼠肾脏损伤中的作用

秦永刚，李晨旭，李 雷，王永杰，卢日峰，杜海英，陈巾宇，郭 丽

（1.吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学公共卫生学院预防医学教学实验中心，吉林 长春 130021；3.吉林大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，吉林 长春 130021）

镉损伤是以肾脏和骨骼损伤为主要中毒表现的环境污染性疾病，目前关于镉对于肾脏损伤机制的国内外文献中，其损伤机制经证实涉及细胞凋亡、氧化应激和脂质过氧化等［1－4］。作为细胞损伤的另一机制，自噬在肾脏损伤中起重要作用［5］，但是自噬在镉所致肾脏损伤中作用的研究较少；已有研究［6］仅以离体细胞作为研究对象研究了自噬在镉造成的肾损伤中的作用，而在体内实验中，自噬在镉所致肾损伤的作用未见报道。本研究拟利用不同浓度氯化镉对Wistar大鼠染毒，制备镉中毒肾损伤动物模型，观察镉对肾脏功能的影响，并对肾脏自噬指标进行检测，探讨自噬在镉损伤中的作用，为临床治疗镉中毒提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 选取40只健康雄性Wistar成年大鼠，体质量（240±20）g，购自吉林大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK－（吉）2008－0005；氯化镉购自天津市复光科技有限公司，LC3B和Beclin1抗体购自美国Epitomics公司。

1.2 动物分组及肾损伤模型制备 将40只大鼠随机分为空白对照组、低剂量染毒组（0.2mg·kg－1CdCl2）、中剂量染毒组（0.4mg·kg－1CdCl2）和高剂量染毒组（0.8mg·kg－1CdCl2），每组10只。染毒组大鼠腹腔注射给予0.2、0.4和0.8mg·kg－1氯化镉溶液制备损伤模型［7－8］，空白对照组大鼠给予等量生理盐水。连续染毒5周，期间大鼠自由饮水饮食，观察大鼠一般状况，并记录大鼠体质量变化。

1.3 肾功能生化指标检测 染毒5周后取各组大鼠全血，用全自动生化仪检测各组大鼠血中肌酐、尿素氮和β2微球蛋白表达水平。

1.4 原子吸收法测定大鼠肾脏组织中镉水平 采用高氯酸与硝酸（1∶4混合）湿法消化大鼠肾脏，定容后采用原子吸收光谱仪测定大鼠肾脏组织中镉水平。

1.5 免疫组织化学法检测大鼠肾脏组织中自噬相关蛋白Beclin1的表达水平 石蜡切片常规脱蜡、脱水，枸橼酸溶液98℃抗原修复5min，内源性过氧化物酶阻断剂室温25min，动物非免疫血清封闭30min，一抗Beclin1（1∶200稀释）4℃过夜，生物素标记的二抗室温40min，链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶30min，DAB显色，苏木精染核5min，弱氨水返蓝，常规脱水、透明，中性树胶封片。采用Image Pro Plus 6.0分析Beclin1积分吸光度（IA）值，以IA值表示Beclin1蛋白表达水平。

1.6 Western blotting法检测大鼠肾脏组织中自噬相关蛋白LC3B相对表达水平 蛋白提取，制备15%分离胶、5%浓缩胶，在样品孔中加入30μg蛋白样品，80V电泳，100mA转膜2h，一抗LC3B（1∶1000稀释）4℃过夜，TBST室温洗膜3次，HRP标记的二抗室温45min，TBST室温洗膜3次，暗室中加ECL发光液，曝光，显影定影。采用Quantity One软件对所得图像进行灰度值分析，重复测量取均值。LC3B相对表达水平＝LC3B灰度值／内参β－actin灰度值。

1.7 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。各组大鼠体质量、血清肌酐、尿素氮、β2微球蛋白、组织中镉水平、Beclin1蛋白表达水平值和LC3B相对表达水平以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用SNK－q法。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状况和体质量 染毒组大鼠在染毒开始后出现食量减少，精神状态萎靡，毛色无光；第3周开始高剂量染毒组大鼠体质量明显低于空白对照组（P＜0.05）；到第5周染毒结束，中剂量染毒组和高剂量染毒组大鼠体质量均显著低于空白对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 不同时间点各组大鼠体质量Tab.1 Body weights of rats at different time points in various groups （n＝10，，m／g）

表1 不同时间点各组大鼠体质量Tab.1 Body weights of rats at different time points in various groups （n＝10，，m／g）

＊P＜0.05compared with blank control group；△P＜0.05compared with low dose group.

0 3 4 5 Blank control 247.80±8.17 306.80±14.27 322.Group Body weight（week）60±22.67 339.40±15.68 CdCl2 Low dose 244.60±6.80 285.20±24.69 298.40±21.53 310.60±22.93 Middle dose 246.20±7.53 285.80±19.08 291.20±13.28 299.00±24.37＊High dose 245.40±7.67 280.20±15.64＊ 284.60±19.37＊ 287.60±28.08＊△

2.2 各组大鼠肾功能生化指标 与空白对照组比较，低剂量染毒组大鼠生化指标表达水平改变不明显，中、高剂量染毒组大鼠血清肌酐、尿素氮和β2微球蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与低剂量染毒组比较，高剂组染毒组大鼠尿素氮和中、高剂量组大鼠血清肌酐表达水平明显升高（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠肾脏组织中镉水平 空白对照组大鼠肾脏中仅见微量镉蓄积，低、中和高剂量染毒组大鼠肾脏组织中均有镉蓄积，且低、中、高剂量染毒组大鼠镉的蓄积量呈递增趋势。与低剂量染毒组比较，中、高剂量染毒组大鼠肾脏组织中镉水平显著升高（P＜0.05）；与中剂量染毒组比较，高剂量染毒组大鼠肾脏组织中镉水平显著升高（P＜0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠肾脏组织中自噬相关蛋白Beclin1的表达水平 空白对照组大鼠肾脏组织基本不表达Beclin1，而染毒组大鼠随着染毒剂量的增加肾脏组织Beclin1的表达水平也随之增加。与空白对照组比较，低、中和高剂量染毒组大鼠肾脏组织中Beclin1表达水平明显升高（P＜0.05）；中、高剂量染毒组大鼠肾脏组织中Beclin1表达水平显著高于低剂量染毒组（P＜0.05），同时高剂量染毒组大鼠肾脏组织中Beclin1表达水平显著高于中剂量染毒组（P＜0.05）。见表3和图1（见插页一）。

表2 各组大鼠肾功能指标Tab.2 Renal function indexes of rats in various groups （n＝10，）

表2 各组大鼠肾功能指标Tab.2 Renal function indexes of rats in various groups （n＝10，）

＊P＜0.05compared with blank control group；△P＜0.05compared with low dose group.

Group BUN［cB／（mmol·L－1）］ CR［cB／（μmol·L－1）］ β2－MG［ρB／（mg·L－1）］Blank control 5.27±0.64 26.4±2.2 1.08±0.03 CdCl2 Low dose 5.63±0.91 26.6±3.1 1.12±0.04 Middle dose 6.51±0.51＊ 31.2±3.4＊△ 1.18±0.06＊High dose 6.85±0.91＊△ 31.6±4.2＊△ 1.17±0.08＊

表3 各组大鼠肾脏组织中镉水平、Beclin1表达水平和LC3B相对表达水平Tab.3 Levels of cadmium，expression levels of Beclin1and relative expression levels of LC3Bin kidney tissue of rats in various groups （n＝10，）

表3 各组大鼠肾脏组织中镉水平、Beclin1表达水平和LC3B相对表达水平Tab.3 Levels of cadmium，expression levels of Beclin1and relative expression levels of LC3Bin kidney tissue of rats in various groups （n＝10，）

＊P＜0.05compared with blank control group；△P＜0.05compared with low dose group；#P＜0.05compared with middle dose group.

Relative expression level of LC3B Blank control 0.18±0.04 347.6±25.9 0.14±0.0 Group Level of cadmium［wB／（μg·g－1）］Expression level of Beclin1（IA）2 CdCl2 Low dose 25.95±2.90＊ 1641.9±221.8＊ 0.32±0.04＊Middle dose 43.62±8.60＊△ 18626.5±610.6＊△ 0.69±0.07＊△High dose 79.54±15.57＊△# 36348.2±718.8＊△# 0.83±0.08＊△#

2.5 各组大鼠肾脏组织中自噬相关蛋白LC3B的相对表达水平 低、中和高剂量染毒组LC3B相对表达水平均较空白对照组显著增加（P＜0.05），且中、高剂量染毒组大鼠肾脏组织中LC3B的相对表达水平较空白对照组、低剂量组显著增加（P＜0.05）。见表3和见图2。

图2 Western blotting法检测各组大鼠肾脏组织中LC3B表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of LC3Bin kidney tissue of rats in various groups detected by Western blotting method

3 讨 论

本研究结果表明：镉染毒5周后，大鼠肾脏功能严重损伤，染毒组大鼠肾功能指标肌酐、尿素氮表达水平显著增高，表明肾脏可能出现急慢性肾炎、重症肾盂肾炎或各种原因导致的急慢性肾功能障碍；β2－微球蛋白表达水平升高，表明肾小管、肾小球可能出现功能性损伤。已有研究［9］表明：镉在一定剂量内即可对肾近端小管细胞造成明显损伤，影响其正常功能；镉也可对肾小体滤过屏障的超微结构造成损伤［10］，致使肾脏功能不全；申元帅［11］的研究结果也支持镉对于肾脏功能的损伤作用，与本实验的研究结果一致。

自噬是一种降解胞质材料和细胞器的溶酶体途径，其在氨基酸饥饿、未折叠蛋白反应和病毒感染等条件下均会被激活［12］，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新［13］。已有研究证实自噬在肾脏损伤中扮演着重要的角色。Inoue等［14］在利用NRK－52E研究肾脏损伤过程中发现：自噬参与了损伤细胞的死亡过程，因此可认为自噬可以作为肾脏细胞损伤的一种指标；而He等［15］认为：自噬可能通过促进肾小管的萎缩和分解来促进肾脏纤维化，也可能通过影响细胞内过度胶原的降解来阻止肾脏纤维化；Wang等［16］发现：在对 MES13细胞加入镉作用后细胞自噬作用明显增强，表明镉对细胞自噬有诱导作用。在本实验中染毒组大鼠肾脏组织中自噬蛋白LC3B及Beciln1表达水平显著升高，而在未染毒大鼠肾脏中其表达水平极低，表明自噬在镉对肾脏的损伤过程中起到了一定的作用。本研究结果表明：在该实验染毒剂量内，肾脏组织中蓄积了大量镉，且随着染毒剂量增加，镉的蓄积量也随之增多，分析其机制可能是镉被吸收转运进入肾脏后，在肾脏中蓄积，损伤肾功能细胞，激活自噬机制，使细胞发生自噬性死亡。

综上所述，镉中毒可导致肾脏组织严重损伤，影响肾脏功能，自噬可能是镉致肾脏损伤的作用机制之一，但其具体机制仍需进一步探究。

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