利用GST融合蛋白表达系统表达与纯化人N-Ras蛋白

张云静 ，冯滢滢，徐小洁，梁迎春，张立，王涛，李玲，郭靖，纪贝贝，张蓉，叶棋浓

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100850；2.第二炮兵总医院，北京 100088；3.总参警卫局 卫生保健处，北京 100017

N-ras基因是由神经母细胞瘤DNA 感染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3 而发现的一种Ras基因，与H-Ras、K-Ras共同组成Ras基因家族。N-Ras基因位于人类1号染色体短臂（1p22-p32），内部含有1个非编码外显子和4 个编码外显子，编码相对分子质量为21×103的蛋白单体（又称为p21 蛋白）。Ras 蛋白是一种位于细胞膜内侧的信号传递小G 蛋白，具有GTP酶活性，在细胞信号转导中起重要作用[1]。它是细胞信号传递中的“分子开关”，与GTP 结合为活化状态，与GDP 结合为失活状态，在细胞的分化与增殖中起重要作用。

Ras基因为癌基因，点突变为其常见的激活方式，约30%的恶性肿瘤存在Ras基因的突变[2]。Ras基因突变激活，其表达产物Ras 蛋白发生构型改变，处于持续活化状态，使细胞增殖失去控制，导致细胞恶性转化[3]。不同Ras基因突变可以导致不同的肿瘤。研究发现，N-Ras基因突变可导致髓系恶性肿瘤[4]、黑色素瘤[5]、甲状腺肿瘤[6]、膀胱癌[7]、恶性胶质瘤[8],研究N-Ras基因在肿瘤的发生、发展及演变过程中的作用有重要意义。为此，我们从人乳腺文库中扩增出N-Ras 蛋白的全长编码序列，利用GST 融合蛋白表达系统构建原核表达载体，诱导并纯化NRas蛋白，为后续深入研究N-Ras基因对肿瘤细胞的影响奠定了实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺文库，大肠杆菌DH5α、Rossate 感受态，原核表达载体pGEX-KG 为本室保存；高保真primer STAR DNA 聚合酶、BamHⅠ和XhoⅠ限制性核酸内切酶、T4DNA 连接酶及其缓冲液、Taq酶为TaKa-Ra 公司产品；PCR 回收、胶回收、质粒提取试剂盒购自Promega 公司；GST-Sepharose 4B 购自Pharmacia公司；人GST 抗体购自Santa Cruz 公司；测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。

1.2 人N-Ras蛋白全长编码区基因的扩增

根据NCBI 查询的人N-Ras 编码序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATGACTGAGTACAAACTGGT GGTG-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGTTACATC ACCACACATGGCAATCC-3'），利用PCR 方法，用高保真primer STAR DNA 聚合酶从人乳腺文库中扩增人N-Ras 编码序列。扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，30 个循环，72℃延长7 min。PCR 结束后，行琼脂糖凝胶电泳，将位置正确的特异条带用胶回收试剂盒回收。

1.3 重组表达质粒的构建、鉴定

将pGEX-KG 载体用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切PCR 回收产物，使其形成带黏端的双链；用T4DNA 连接酶将其连接入pGEXKG 载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，振荡培养并提质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序。

1.4 融合蛋白GST-N-Ras 在大肠杆菌中的小量诱导表达及鉴定

将鉴定正确的重组表达质粒转化大肠杆菌Rossate 感受态细胞，挑取菌落至含有氨苄西林的LB 液体试管中，37℃振荡培养至D600nm为0.6～1.0，取500μL 菌液用于保菌，取500μL 菌液离心收集菌体作为诱导前对照，剩余菌液中加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L，37℃继续培养4～6 h，取500μL菌液离心收集菌体作为诱导后样品，进行SDS-PAGE检测。

1.5 融合蛋白GST-N-Ras的纯化与洗脱

将小量诱导表达及鉴定正确的Rossate 菌接种于含氨苄西林的LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜活化，按10%的比例转种于同种液体培养基中，30℃振荡培养至D600nm为0.4～0.6，加入IPTG 至终浓度为0.1 mmol/L，于20℃温箱中继续培养16～20 h，4℃、10 000 r/min 离心10 min 后收集菌体，加入裂解液，吹匀后冰浴30 min，用超声波仪破碎菌体，4℃、10 000 r/min 离心10 min 后收集上清，加入200μL GST-Sepharose 4B 结 合4 h，离心收 集GST-Sepharose 4B 小颗粒，充分洗脱后即为结合蛋白质。利用还原性谷胱甘肽小量多次地将GST-NRas 从珠子上逐渐洗脱，最后经SDS-PAGE 鉴定纯化与洗脱的蛋白。

2 结果

2.1 人N-Ras编码区基因的克隆

以人乳腺文库为模板，PCR 扩增N-Ras 编码区全长序列，获得与预期片段大小一致的600 bp 左右的PCR产物（图1）。

2.2 重组表达载体的构建与鉴定

用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pGEX-KG 载体，胶回收较大片段；将PCR 产物用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后胶回收；用T4DNA 连接酶及其缓冲液将上述2片段连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑克隆，利用Taq酶行菌液PCR，经琼脂糖凝胶电泳，条带大小约为600 bp 者为阳性克隆（图2）；将阳性克隆提质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，如在600 bp 左右出现特异条带（图3），表明N-Ras 的编码序列已成功插入pGEX-KG 上游的多克隆位点中。经DNA 序列测定，该序列与已知序列完全一致，无突变发生（序列数据略）。

2.3 融合蛋白GST-N-Ras的诱导表达及鉴定

将鉴定正确的重组表达质粒转化Rossate 感受态细胞，挑取菌落至含氨苄西林的LB 液体试管中,37℃振荡培养至D600nm为0.6～1.0，取500μL 菌液离心收集菌体作为诱导前对照，后加入IPTG 至终浓度为1 mmol/L，37℃培养4～6 h，取500μL 菌液离心收集菌体作为诱导后样品，行SDS-PAGE，发现GST-N-Ras融合蛋白获得正确表达（图4）。

图1 N-Ras基因的PCR扩增产物

2.4 融合蛋白GST-N-Ras的纯化与洗脱

用GST-Sepharose 4B 亲和珠纯化得到融合蛋白，经还原性谷胱甘肽小量多次洗脱，考马斯亮蓝染色结果显示获得一定量的纯度较高的GST-N-Ras（图5）。

3 讨论

Ras家族有三大成员，即K-Ras、H-Ras和NRas。目前，研究报道比较多、机制相对较明确的是K-Ras对肿瘤细胞的影响及耐药性的研究，而对于N-Ras基因与肿瘤的报道相对较少。Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/PTEN 信号传导通路对细胞的生长、繁殖与分化具有重要意义[9-13]，而N-Ras基因是该信号通路中重要的调控因子，N-Ras基因的突变可致细胞持续生长，甚至肿瘤发生[5]。

图2 重组质粒的菌液PCR结果电泳图谱

图3 重组质粒的BamHⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定

有研究报道，N-Ras第61 位密码子发生点突变占所有Ras突变的67%～88%[14-15]，而且不同肿瘤组织中N-Ras基因的表达率不同[16]。Colombino 等[17]报道，在15%N-Ras基因突变的黑色素瘤患者中，黑色素瘤细胞增殖与N-Ras基因密切相关，随着黑色素瘤细胞的增殖，细胞内N-Ras的蛋白和mRNA 水平显著增加。在甲状腺滤泡状癌中，N-Ras第61 位密码子发生点突变是比较普遍的（突变率26.8%），这种突变的发生为临床上更为精确地诊断甲状腺癌提供了证据，同时也能预测甲状腺滤泡状癌的危险程度[18]。在急性髓系白血病[4]、多发性骨髓瘤[19]患者中也存在N-Ras突变的情况，其机制可能是由于突变导致编码的Ras 蛋白构型改变，使其处于功能持续活化状态，从而激活了Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT等下游信号传导通路，最终导致疾病的发生，但具体机制还有待于继续深入研究。也有个案报道，在原发性脑间质肿瘤、痣同时伴有神经与皮肤恶性黑色素瘤患者中，发现存在N-Ras基因第13 位密码子的突变，这可能是多种因素作用的结果，研究者推断与RAF-MEK-ERK、RalGDS、PI3K-AKT/PDK1和PLC/PKC 信号通路有关，具体机制需要深入研究[20]。尽管有充足的实验数据证明N-Ras基因突变与多种肿瘤的进展、恶性转化及预后密切相关，但其具体作用机制、临床上的指导意义及其耐药性还不是十分清楚，为我们进一步深入研究指明了方向。

综上，我们利用原核表达系统诱导表达了重组蛋白GST-N-Ras，并用Sepharose-4B 珠子对重组蛋白进行了纯化，为后续深入研究N-Ras基因影响肿瘤细胞的具体机制奠定了实验基础。

图4 GST-N-Ras融合蛋白的SDS-PAGE分析

图5 GST-N-Ras融合蛋白纯化并洗脱后的SDS-PAGE分析

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