猴头菌原生质体制备及单核体鉴定研究

张琪，刘宏伟，陈娟，郭顺星

猴头菌原生质体制备及单核体鉴定研究

张琪，刘宏伟，陈娟，郭顺星

目的 通过优化猴头菌原生质体的制备条件，结合荧光染色鉴定及分子鉴定获得高纯度的单核体，为进一步开展猴头菌基因组水平的研究提供材料。

猴头菌； 原生质体； 单核体； 荧光染色

猴头菌（Hericium erinareus）是一种珍贵的食药用真菌，含有萜类、酚类等生物活性物质，对提高人体免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、调节中枢神经等具有显著功效。尤其是猴头菌子实体产生的神经保护成分猴头菇菌素广受国内外关注。目前国内外对猴头菌的研究多集中在活性成分分离及其药理活性方面［1-2］，但对猴头菌分子生物学尤其是活性成分的生物合成机制报道较少。基因组学技术的发展为深入研究猴头菌次生代谢产物的合成提供有力工具。目前猴头菌的功能基因组学研究尚未开展。猴头菌子实体一般由二倍体菌株发育而来，含有两套不同的染色体，基因组复杂度较高，测序解析困难。因此获得单核体是基因组测序工作的前提和基础。在获得单核体的方法中，原生质体单核化法所获得的单倍体菌株不经过重组，因而更能完整地展示二倍体亲本的遗传信息［3］。然而单核体的再生有一定的困难，所以需要高产量的原生质体为基础。酶解法是制备原生质体的一种常用方法，而酶的种类、酶解条件、培养基的成分［4］都对原生质体的释放有很大的影响。本文优化了猴头菌原生质体的制备条件，结合荧光染色及分子鉴定获得了高纯度的单核体，为进一步开展猴头菌基因组水平的研究提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 发酵的猴头菌菌丝由中国科学院微生物所提供，经 PDA培养基纯化获得，并经 DNA序列鉴定属于猴头菌。

1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，水 1000 ml，pH=5.5。葡萄糖培养基：葡萄糖 20 g，蛋白胨 2 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水 1000 ml，碳源筛选时分别以麦芽糖、蔗糖、淀粉替代培养基中的葡萄糖。综合培养基：在葡萄糖培养基中分别加入马铃薯、燕麦、麦麸各 200 g。除培养基筛选实验，其余实验材料均用添加马铃薯的培养基进行培养。PDP培养基：马铃薯培养基中除去 KH2PO4和MgSO4·7H2O。再生培养基：马铃薯培养基中加入KCl，使终浓度为 0.6 mol/L。

1.1.3 试剂 溶壁酶购自广东微生物所；蜗牛酶及纤维素酶购自北京佳辰科技有限公司；DAPI荧光染色剂购自瑞士 Roche公司；CTAB植物基因组 DNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌丝培养 将发酵产物在 PDA平板上进行活化。取培养皿边缘菌丝，尽量打碎，以每 100 ml培养液接种一皿菌丝的比例进行操作。接种后的菌丝先摇床培养 96 h（120 r/min，25℃），再静置培养 72 h，整个操作需无菌且每个处理重复 3次。菌龄筛选实验中的静置培养时间分别为 48、72、96、120、144 h。

1.2.2 原生质体制备 发酵菌丝经蒸馏水冲洗后用 0.6 mol/L KCl稳渗剂冲洗 3次，滤纸吸干水分。按照每 100 mg干湿菌丝加入 1 ml酶液的比例进行酶解反应［5］。反应结束后采用 200目铜网过滤除去残余菌丝，得到的滤液 5000 r/min离心10 min，所得沉淀用 0.6 mol/L KCl稳渗剂冲洗，最后用 1 ml 0.6 mol/L KCl稳渗剂溶解，血球计数板计数。

1.2.3 原生质体再生 将制得的原生质体稀释100倍，取 150 μl涂板，设置 3个重复。

单核菌丝再生率 =｛［（再生菌落数 –再生双核菌落数）×1000×100/3×150］/原生质体数｝× 100%

1.2.4 影响原生质体释放的因素

酶系统筛选实验：观察 1.5%的单一酶系统（溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶），1.5%的纤维素酶和蜗牛酶的混合酶系统，2%的溶壁酶系统酶解 2、3、4 h的原生质体释放过程。观察溶壁酶浓度分别为 1%、1.5%、2%、3%、4%酶解 3 h的原生质体释放情况。

酶反应体系中的因素筛选实验：酶解温度、pH及渗透压稳定剂都对结果有影响。本文分别对稳渗剂（无机和有机），pH（3.5～6.5）、酶解温度（20～40℃）等条件进行考察。

培养基及菌龄筛选实验：对碳源及综合培养基中添加的成分进行筛选。同时对菌龄为 48～144 h的菌丝进行原生质体释放量的观察。

1.2.5 单核菌丝鉴定 单核菌丝的鉴定方法包括：性状鉴定、一般显微鉴定、荧光显微鉴定。用于荧光染色鉴定的菌丝用 3 mol/L的 DAPI荧光染液于 37℃ 染色 20 min，后用 PBS缓冲液冲洗3次置于荧光显微镜下进行观察。同时，使用CTAB法对获得的单核菌丝进行 DNA提取，采用担子菌 ITS序列通用引物：ITS4/ITS5［6］（5'TCCT CCGCTTATTGATATGC 3'/5'GGAAGTAAAAGTC GTAACAAGGA 3'）扩增单核菌丝核糖体内转录间隔区（ITS）序列，将得到的序列在 GenBank数据库中检索。

2 结果

2.1 影响原生质体释放量的因素

2.1.1 酶系统的选择 真菌的细胞壁比较特殊，含有多糖、蛋白质和几丁质［7］，因此选择合适的酶系统是这些多糖物质降解的关键。试验是在 30℃，pH 5.5时，以 0.6 mol/L KCl为渗透压稳定剂的条件下进行，取 3次重复实验的平均值。

从图 1可以看出各酶系统的最大释放量均出现在 3 h处。浓度为 1.5%的单一酶系统中，溶壁酶的效果最好，蜗牛酶的效果最差。浓度为 1.5%的混合酶系统中，含 1%蜗牛酶的酶系统酶解效果较好，其结果与 1.5%溶壁酶所得结果相似，但考虑到混合酶体系操作繁琐，所以选择单一酶系统。将溶壁酶浓度增加到 2%，原生质体的释放量显著增大。

图1 酶系统对原生质体释放量的影响（R：溶壁酶；S：蜗牛酶；C：纤维素酶）Figure 1 The influence of enzyme type on the preparation of protoplast（R:lywallzyme；S:snailase；C:cellulose）

2.1.2 溶壁酶浓度对猴头菌原生质体制备率的影响 酶浓度是原生质体释放量的一个关键条件，浓度太低，破壁困难，原生质体产量不足；浓度太高，易使原生质体变形，甚至破裂，反而产量下降。

图2表明，溶壁酶浓度较低时，原生质体的产量随着酶浓度的增加而提高。溶壁酶浓度达 2%时，原生质体产量最高，为 2.11×107/ml，当溶壁酶浓度超过 2.0%时，原生质体产量随着酶浓度的增加而降低。

图2 溶壁酶浓度对猴头原生质体释放量的影响Figure 2 The influence of lywallzyme concentration on the preparation of protoplast

2.1.3 培养基对猴头原生质体制备率的影响 培养基成分对真菌原生质体的释放量有显著的影响［2］，由图 3可以看出马铃薯培养基培养菌丝的原生质体释放量最高为 1.53×107/ml。葡萄糖和麦芽糖为碳源的培养基所得释放量较高，而蔗糖和淀粉的则较低，考虑是由于真菌不能利用蔗糖和淀粉导致的。PDP培养基的释放量相对较低，说明 KH2PO4和 MgSO4·7H2O是培养基中必要的成分。燕麦培养基的释放量最低，说明燕麦培养基不适合猴头菌的生长和原生质体的释放。本试验所用酶为 1.5%溶壁酶，其余条件同 2.1.1。

图3 培养基的种类对原生质体释放量的影响Figure 3 The influence of medium type on the preparation of protoplast

2.1.4 渗透压稳定剂对猴头原生质体制备率的影响 由图 4可以看出以 KCl为稳渗剂的原生质体释放量最高为 1.50×107/ml。其后依次是甘露醇、MgSO4·7H2O、葡萄糖、蔗糖和 NaCl。

2.1.5 菌龄对猴头原生质体制备率的影响 由图 5可以看出，菌龄 72 h的菌丝所释放的原生质体的数量最多，为 1.69×107/ml。菌龄 48 h的菌丝释放量较低，考虑是制得的原生质体易破裂所致。菌龄超过 72 h，原生质体释放量呈逐渐减少的趋势。

图4 渗透压稳定剂的种类对原生质体释放量的影响Figure 4 The influence of osmotic stabilizer type on the preparation of protoplast

图5 菌龄对原生质体释放量的影响Figure 5 The influence of mycelial age on the preparation of protoplast

2.1.6 酶解温度对猴头原生质体制备率的影响 酶解温度对原生质体产量影响显著，随着溶壁酶酶解温度的升高，原生质体产量变化趋势明显。如图 6所示，当酶解温度是 30℃ 时，其原生质体产量最高，为 2.11×107/ml。温度高于 35℃ 或低于 25℃ 时原生质体产量显著下降，因此，猴头菌酶解温度以 30℃ 为宜。

2.1.7 pH对猴头原生质体制备率的影响 由图 7可知，pH 4.5～5.5效果相对较好，尤以 pH 5.5效果最佳。酶液的 pH条件主要影响溶壁酶系统和渗透压稳定剂活性，所以对猴头菌来说 pH 4.5～5.5最适合溶壁酶的脱壁作用。

图6 酶解温度对猴头原生质体产量的影响Figure 6 The influence of hydrolysis temperature on the preparation of protoplast

图7 pH对原生质体产量的影响Figure 7 The influence of pH on the preparation of protoplast

图8 PDA平板培养的猴头菌单核及双核菌丝（A：菌龄 20 d的单核菌丝；B：菌龄 7 d的单核菌丝；C：菌龄 20 d的双核菌丝；D：菌龄 7 d的双核菌丝）Figure 8 The monokaryontic and multinucleated mycelia which cultured by PDA medium（A:Monokaryontic mycelia of 20 d；B:Monokaryontic mycelia of 7 d；C:Multinucleated mycelia of 20 d；D:Multinucleated mycelia of 7 d）

2.2 原生质体的再生

对再生出的 32个菌落进行筛选，镜检结果有24株有锁状联合，涂板所用原生质体的浓度为0.53×107/ml。单核菌丝的再生率为 0.034%。

2.3 单核菌丝的鉴定

2.3.1 性状鉴定 单核菌丝生长较规则、洁白（图 8A、B）；双核菌丝生长不规则，且有分泌色素使培养基染色的情况发生（图 8C、D）。显微观察显示，单核菌丝分枝少，无锁状联合（图 9A）；双核菌丝分枝较多，锁状联合及孢子清晰可见（图9B）。荧光染色观察显示，单核菌丝核距远，菌丝交叉较少（图 10A）；双核菌丝核距较近，菌丝交叉较多（图10B）。

2.3.2 分子鉴定 测序得到的 ITS序列约650 bp，经 Blast与基因库里的克隆自猴头菌的一段序列相似，相似性达 99%，说明再生出来的为猴头菌。

图9 菌龄 20 d的单核及双核菌丝的显微结构［A：单核菌丝，比例尺：20 μm；B：双核菌丝，可见锁状联合及孢子（箭头所示），比例尺：10 μm］Figure 9 Microstructure of monokaryontic and multinucleated mycelia of 20 d［A:Monokaryontic mycelia，scale bar，20 μm；B:Multinucleated mycelia，clamp connection and spores indicated by the black arrows，scale bar，10 μm］

由实验结果可知，在综合葡萄糖培养基上培养72 h的菌丝，用 2% 的溶壁酶液，以 0.6 mol/L KCl为渗透压稳定剂，在 pH 5.5的培养基条件下酶解3 h，可获得最大量猴头菌的原生质体。制得的原生质体再生后筛选出的菌丝经显微鉴定证明是单核菌丝，经分子鉴定证明是猴头菌。说明通过原生质体单核化得到的菌丝可以用作猴头菌基因组测序。

图10 荧光显微镜观察菌龄 20 d的单双核菌丝，单、双核清晰可辨［A：单核菌丝荧光染色观察，核距较远（箭头所示），比例尺：10 μm；B：双核菌丝荧光染色观察，核距较近（箭头所示），比例尺：10 μm］Figure 10 Microstructure of monokaryontic and multinucleated mycelia of 20 d using fluorescence microscope，mononuclear and dicaryon can be clearly recognized［A: Observationswith fluorescentstaining ofmonokaryontic mycelia，large separation between cell nucleus indicated by the white arrows，scale bar，10 μm；B:Observations with fluorescent staining of multinucleated mycelium，small separation between cell nucleus indicated by the white arrows，scale bar，10 μm］

3 讨论

本实验中所得最适菌龄为 72 h，与之前报道的96 h［8］有所不同，可能是由于所用培养基成分不同导致的，所以进行培养基的成分筛选是很有必要的。此外本实验的原生质体得率较李艳红等［9］及刘莉等［10］得出的结果高出一个数量级，可能的原因是本实验中采用的菌丝与酶类比例较高所致。

担子菌的原生质体释放量同为 107个/ml数量级的试验中，再生率及再生单双核菌丝之比差异较大。潘迎捷等［11］在研究香菇原生质体的再生时，得出再生的单双核菌丝之比为 0.85∶1～2.34∶1。李刚和李宝健［12］在研究灵芝的原生质体再生时，发现其菌丝再生率范围为（1.44±0.14）×10-1～（5.42± 0.82）×10-1。范秀芝等［13］在研究黑木耳时，发现单双核菌丝再生率之比为 25∶17。本实验单核菌丝的再生率为 0.034%，单双核菌丝再生率比约为 1∶3。本实验中菌丝再生率及单核菌丝再生比例均较低，考虑是由于再生培养基琼脂的含量、原生质体的涂布量以及渗透压稳定剂种类等因素导致的，因此今后的研究可进一步对原生质体再生条件进行优化。

［1］ Gao JM，Huang Y.Diterpenoids of higher fungi and their biological activity.Chin Traditional Herbal Drugs，1999，30（10）:787-791.（in Chinese）

高锦明，黄悦.高等真菌中二萜类成分及其生物活性.中草药，1999，30（10）:787-791.

［2］ Lu QQ.The secondary metabolic product of Hericium erinanceus and their bioactivity.Shanxi Yangling:Northwest A&F University，2013.（in Chinese）

路强强.猴头菌次生代谢产物及其生物活性研究.陕西杨凌:西北农林科技大学，2013.

［3］ Zhao J，Chang ST.Monokaryotization by protoplasting heterothallic species of edible mushrooms.World J Microbiol Biotechnol，1993，9（5）:538-543.

［4］ Peberdy JF.Fungal protoplasts:isolation，reversion，and fusion. Annu Rev Microbiol，1979，33:21-39.

［5］ Xing L.Selection of pleurotus ostreatus asexual regenerative strains by protoplast regenration.Baoding:Agricultural University of Hebei，2008.（in Chinese）

邢蕾.平菇原生质体再生及无性变异株的初筛.保定:河北农业大学，2008.

［6］ White TJ，Brnst L.Analysis of phytogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes.New York:Academic Press，1990:315-322.

［7］ Bowman SM，Free SJ.The structure and synthesis of the fungal cell wall.Bioessays，2006，28（8）:799-808.

［8］ Ma XD，Zhou FZ，Wu HJ，et al.The reasearch of mycelial protoplasts from hericium erinaceus.Henan Sci，1995，13（1）:65-69.（in Chinese）

马向东，周伏忠，吴浩洁，等.猴头菌原生质体制备条件的研究.河南科学，1995，13（1）:65-69.

［9］ Li YH，Li L，Pan YN.Study on the separating condition of protoplast in hericium erinaceus.J Microbiol，2006，26（3）:28-30.（in Chinese）

李艳红，李莉，潘延宁.猴头菌原生质体分离条件研究.微生物学杂志，2006，26（3）:28-30.

［10］LiuL，XiaoZY，GuoLQ，etal.Establishmentofgenetic transformation system of Hericium erinaceus using PEG mediated method.Mycosystema，2014，33（1）:121-128.（in Chinese）

刘莉，肖招燕，郭丽琼，等.PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立.菌物学报，2014，33（1）:121-128.

［11］Pan YJ，Liao HQ，Zhang ST，et al.A study on monokaryotization by protoplasting of heterokaryotic mushrooms.Acta Agric Shanghai，1993，9（2）:1-5.（in Chinese）

潘迎捷，廖汉泉，张树庭，等.异宗结合食用菌的原生质体单核化.上海农业学报，1993，9（2）:1-5.

［12］Li G，Li BJ.Study on the separation and regeneration of Ganoderma protoplast.Mycosystema，1999，18（1）:79-88.（in Chinese）

李刚，李宝健.灵芝原生质体分离与再生研究.菌物系统，1999，18（1）:79-88.

［13］Fan XZ， Zhou Y， Bian YB. Rapid identification of protoplast-regenerated monokaryotic isolates of Auricularia auricula-judae based on an allele InDel marker.Mycosystema，2014，33（2）:273-279.（in Chinese）

范秀芝，周雁，边银丙.基于等位基因 InDel快速检测黑木耳原生质体单核体.菌物学报，2014，33（2）:273-279.

Methods The preparation conditions of Hericium erinaceus protoplast were studied systematically.These conditions included three types of enzyme systems；concentrations of lywallzyme；inorganic and organic osmotic stabilizers；pH 3.5～6.5；decomposition temperature between 20～40℃，and medium component and mycelium age.Three types of enzyme systems were 1.5%single enzyme system （lywallzyme，cellulose，snailase），1.5%mixed enzyme system consisting of cellulase and snailase and 2% lywallzyme system.The concentrations of lywallzyme were 1%，1.5%，2%，3%and 4%.The medium components included type of carbon source and additive ingredients in synthetic medium.Mycelial age changed from 48 h to 144 h.The protoplast was diluted and inoculated on the regeneration plate.The regenerative mononuclear body is selected by morphological identification，observation of general and fluorescence microscope，and molecular identification by ITS analysis.

Results The highest yield of protoplast can be acquired by using the liquid fermentation mycelium which were cultured in potato medium for 72 h.The optimal treatment conditions consisted of 2%lywallzyme in 0.6 mol/L KCl，pH 5.5 and 30℃.

Conclusion The mononuclear body which is regenerated from protoplast can lay a foundation for genomic study of the Hericium erinaceus secondary metabolism.

Study on the preparation of protoplast and mononuclear identification of Hericium erinaceus

ZHANG Qi，LIU Hong-wei，CHEN Juan，GUO Shun-xing

Objective To obtain the mononuclear mycelia for further genomic research.

Hericium erinaceus；Protoplasts；Mononuclear mycelia；Fluorescent dyeing

s:GUO Shun-xing，Email:sxguo1986@163.com；CHEN Juan，Email:kibchenjuan@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.004

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2014CB138304）作者单位：250000济南，山东中医药大学药学院（张琪）；100101北京，中国科学院微生物研究所（刘宏伟）；100193北京，中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所（陈娟、郭顺星）

陈娟，Email：kibchenjuan@126.com；郭顺星，Email：sxguo1986@163.com

2014-09-29

方法 对三类酶系统、溶壁酶浓度、无机和有机两类稳渗剂、pH 3.5～6.5、酶解温度 20～40℃、培养基成分以及菌龄为48～144 h菌丝的原生质体制备条件进行考察。其中三类酶系统分别为：1.5%的单一酶系统（溶壁酶、纤维素酶、蜗牛酶），1.5%的纤维素酶和蜗牛酶的混合酶系统，2%的溶壁酶系统；溶壁酶浓度：1%、1.5%、2%、3%、4%；培养基成分的考察：碳源种类筛选及综合培养基中添加成分的筛选。将制得的原生质体稀释后涂板再生及鉴定，以选取单核菌丝。单核菌丝的鉴定方法包括：性状、显微及分子鉴定。其中显微鉴定的观察方法包括一般显微观察和 DAPI荧光染色观察；分子鉴定扩增的是单核菌丝的核糖体内转录间隔区（ITS）序列。

结果 在马铃薯培养基中静置培养 72 h的猴头菌丝，用2% 的溶壁酶液，以 0.6 mol/L KCl为渗透压稳定剂，在 pH 5.5、温度 30℃ 的条件下酶解 3 h，原生质体的释放量最大；再生的单核体经形态及分子生物学鉴定证明是猴头菌。结论 通过原生质体制备及再生方法获得的猴头菌的单核菌丝可以为猴头菌活性次生代谢产物相关基因的发掘奠定基础。

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术，2015，10（2）:113-118

Author Affiliations:Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250000，China（ZHANG Qi）；Institute of Microbiology，Chinese Academy of Science，Beijing 10010，China（LIU Hong-wei）；Institute of Medical Plant Development，ChineseAcademy of Medical Science&Peking Union Medical College，Beijing 100193，China（CHEN Juan，GUO Shun-xing）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:113-118