粘杆菌素流加补糖发酵工艺研究

李为全,王 洲

(1．安徽省皖北药业股份有限公司,安徽宿州 234000; 2．安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

粘杆菌素流加补糖发酵工艺研究

李为全1,王 洲2

(1．安徽省皖北药业股份有限公司,安徽宿州 234000; 2．安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

粘杆菌素发酵老工艺发酵周期短,发酵单位比较低．研究了流加补糖新工艺,通过发酵过程流加葡萄糖,解除了物料浓度过高抑制粘杆菌素合成速率的问题．同时结合对发酵接种量、培养温度等参数的优化,使粘杆菌素发酵单位由110 000 U/m L提高至520 000 U/m L,并把该工艺成功地运用到生产中．

粘杆菌素;流加补料;发酵

粘杆菌素是由多粘类芽胞杆菌(Bacilluspolymgxa)产生、多种氨基酸和脂肪酸组成的一种碱性多肽类抗生素,对革兰氏阴性杆菌有强烈的杀菌作用．由于粘杆菌素具有较好抗菌谱和高效(大多数菌株最小抑菌浓度＜6．25 ug/m L)、低毒、残留少的特性,已经被广泛应用于养殖畜牧业[1-2]．

粘杆菌素发酵老工艺一般采取37℃高温培养的方式．由于培养温度比较高,发酵过程菌体衰老较快,导致发酵周期一般较短;发酵老工艺采取基础料一次性加入,发酵基础物料浓度比较高,消毒过程不好控制,特别是对淀粉的液化程度的控制不好把握,淀粉的浓度高,发酵过程菌体的代谢速率慢,发酵过程起步效价相对较低,每天单位增幅小,发酵结束时由于菌体的活力减弱,料液中残留的糖浓度高,料液粘稠,提取难度大,提取出的产品纯度达不到高端客户的需求．为解决这个问题,对老的发酵工艺进行了优化．主要思路是通过发酵基础配方的调整,降低了发酵基础配方中碳源的浓度;采取发酵过程流加补入葡萄糖的方式[3-4],提高了发酵过程生物合成速率;通过对发酵接种量、培养温度的优化,提高了发酵起步效价和延长了生产合成周期,提高了发酵放罐时的产物浓度;放罐发酵液中产物浓度的提高非常有利于提取产品质量的提高和成本的降低．该工艺已被应用于实际生产中,提高了产品的竞争力．

1 材料和方法

1．1 菌株来源

出发菌株sy-7,由安徽省皖北药业股份有限公司保存使用．摇瓶发酵生产能力测定平均效价为76 000 U/m L．

1．2 培养基

斜面培养基(g/L):葡萄糖5、KH2PO41、蛋白胨1．5、酵母膏1、琼脂20,p H 7．0．

种子培养基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨4、酵母膏1、NaCl 2、CaCO34,p H 7．0～7．2．

发酵培养基(g/L):淀粉浓度20、蛋白胨30、(NH4)2SO410、小麦胚芽粉15、NaCl 10、KH2PO40．6、CaCO36,p H 6．5～6．8．

葡萄糖液浓度:50%．

1．3 分析方法

发酵效价测定:发酵液经12 000 r/min离心10 min,取上清液采用HLPC测定粘杆菌素含量[5]．菌体形态检查:美兰染色,光学显微镜观察法．总糖及还原糖的检测:蒽酮比色法[6]．游离氨基氮的检测:甲醛氧化测定[6]．

1．4 培养方法

培养条件:斜面、摇瓶种子及发酵培养,温度33℃;斜面培养周期3 d,种子培养周期28 h;摇瓶发酵装液量100 m L/500 m L,转速220 r/min,发酵周期48 h．不补料50 L罐发酵37℃培养48 h,补料50 L罐发酵33℃培养96 h．

流加补糖发酵工艺:流加补糖发酵培养温度经试验摸索采用33℃培养,发酵周期为4 d．发酵过程流加补入葡萄糖液,采用蠕动泵压入．

补糖速率:根据发酵液残糖的浓度,控制补入糖液;通过氨水自控补入,控制p H 6．0±0．05．

2 结果与讨论

2．1 流加补糖速率控制及发酵过程还原糖浓度控制

老工艺发酵过程不补料,新工艺发酵采取流加补糖工艺．发酵接种后,开始流加补入葡萄糖,每12 h补入液糖速率为发酵初始体积的2%,8 h后随着菌量增加,逐渐提高补糖速率,20 h后随着菌体浓度增大,逐渐进入生产期,每12 h补糖速率控制在3．6%,30 h后补糖速率达到最大;30～70 h,每12 h补糖速率在3．8%;70～90 h糖耗速率逐渐降低,相应降低补糖速率．发酵过程根据发酵液总糖质量浓度,适量调整补糖速率,一般控制发酵液总糖质量浓度为0．3～2．0 g/100m L范围比较好．

新、老工艺发酵过程总糖含量的变化如图1所示．由图1可以看出,老工艺发酵初始总糖为13%,发酵过程中糖质量浓度逐渐下降,放罐时总糖质量浓度为4%,比较高,不利于提取,造成浪费;流加补糖工艺发酵过程总糖质量浓度在0．5%～2．5%之间,放罐时残糖浓度比较低,有利于提取,同时也有利于减轻环保处理的压力．

2．2 接种量对发酵过程的影响

老工艺和新工艺30 h起步效价比较如图2所示．由图2可以看出,不补糖粘杆菌素发酵工艺,接种量为1．0%,比较小,前期发酵起步效价比较低,发酵30 h发酵起步效价只能够达到40 000 U/m L左右．采取流加补糖发酵工艺后,优化了发酵接种量工艺,通过研究发现增大发酵接种量可以明显提高发酵起步效价和中期前的生物合成速率．通过小试罐工艺摸索确定发酵接种量为3%～5%,发酵起步效价比较高,发酵30 h起步效价可以达到100 000 U/m L．

2．3 发酵培养温度的优化及发酵周期的变化

老的生产工艺发酵培养基淀粉浓度高,菌体的代谢速率比较低,发酵培养温度为37℃,发酵周期为40～60 h,发酵周期比较短．采取流加补糖工艺后,降低了基础料淀粉的浓度,解除了基质的抑制．在摇瓶中考察了不同培养温度31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃对产量的影响,结果如图3所示．由图3可以看出,该菌种33℃下发酵单位最高,降低了发酵培养温度,采取33℃培养,菌体衰老变慢,菌体形态比较好,粘杆菌素的旺盛合成期明显延长,整个发酵周期得到延长．发酵过程由于采取流加补糖,使发酵液残糖处于菌体代谢的最适状态,满足了菌体代谢需要,增大了发酵体积,发酵产量明显提升．

2．4 不同发酵工艺粘杆菌素发酵单位比较

老工艺和新工艺发酵单位变化趋势如图4所示．不补料的老工艺基础料淀粉质量浓度为13%,一次性投入,淀粉浓度高,还原糖浓度高,发酵中、前期易产生高浓度基质,抑制菌体生长和影响发酵过程粘杆菌素生物合成的启动．从图4可以看出,发酵30 h效价为44 000 U/m L,发酵48 h发酵单位达到约115 500 U/m L,发酵周期延长后单位不再增加,发酵单位比较低．流加补糖新工艺采取基础料加入少量淀粉,发酵过程根据菌体代谢速率流加补糖,满足菌体的代谢需求．发酵过程由于糖浓度可以控制在最适的范围,促进了菌体的代谢速率,过程合成速率明显提高．发酵30 h发酵单位达到100 000 U/m L,发酵60 h发酵单位达到420 000 U/m L,发酵96 h发酵单位达到520 000 U/m L．发酵80 h后发酵单位增幅明显变小,因此最佳发酵周期为4 d．

3 结论

以50 L发酵罐进行粘杆菌素发酵工艺研究．粘杆菌素老的生产工艺,发酵基础料中淀粉一次性加入,发酵过程不补糖,接种量比较小,培养温度37℃,发酵周期为48 h,比较短,放罐效价低,生产上发酵单位只能达到110 000 U/m L,提取生产成本高,产品的质量不高．而流量补糖发酵工艺,通过对发酵基础配方、流加补糖、培养温度、接种量进行了系统研究,发酵4 d,发酵单位达到520 000 U/m L,提高了粘杆菌素的发酵生产水平,降低了生产成本．

[1] 赖滨霞．粘杆菌素高产菌株的选育[J]．福建畜牧兽医,2010,32(6):19-20．

[2] 李德培．抗革兰氏阴性菌促长药物-粘杆菌素[J]．兽药与饲料添加剂,1999,4(1):21-24．

[3] 丁煜．用分批补加培养基研究林可霉素生物合成工艺[J]．国外医药抗生素分册,1996,17(1):21-23．

[4] 李继安,林惠敏,牛金刚,等．流加补料技术在林可霉素发酵中的应用[J]．中国医药工业杂志,2012,43(9):739-740．

[5] 国家药典委员会．中华人民共和国药典[M]．北京:中国医药科技出版社,2000．

[6] 王秀奇,秦淑媛,高天慧,等．基础生物化学实验[M]．北京:高等教育出版社,2005．

Study on fermentation process of colistin by flow feed in sugar

LI Wei-quan1,WANG Zhou2
(1．Wan Bei Pharmaceutical Co．Ltd．,Suzhou 234000,China; 2．College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

The old fermentation process of colistin has the disadvantages of short fermentation period and low fermentation unit．This paper developed a new sugar supplement test for colistin and studied the fed sugar fermentation process of colistin．By using fed glucose fermentation process,the inhibition of colistin synthesis rate due to the high glucose concentration can be relieved．Combined with the optimization of fermentation inoculum and culture temperature parameter,the colistin fermentation unit can go up from 110 000 U/m L to 520 000 U/m L．And this technology has been successfully applied to large-scale production．

colistin;flow feeding;fermentation

Q815

A

1672-2477(2015)04-0017-03

2015-02-16

李为全(1975-),男,安徽宿州人,工程师,硕士．