梨废渣发酵生产菌体蛋白的研究

柴云雷， 王 鹏， 张 晟， 刘丽美， 郭 丽

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化152061）

梨皮含有丰富的矿物质、维生素、脂肪和蛋白质等，营养价值较高。 梨皮具有清心润肺、降火生津等功效，常用于治疗暑热烦渴、咳嗽、吐血等症状。 梨核含有多种维生素，尤其是维生素B 含量较多，此外梨核中还含有蛋白质、糖类、阿拉伯胶和木质纤维等营养物质。 梨核的保健作用更优于梨肉，具有清热去火、润肠通便、保护肝脏、降低胆固醇、预防心脏病和防癌抗癌等功效（陈倩颖等，2021；张想等，2021；关玉婷等，2021）。

菌体蛋白又称单细胞蛋白（SCP）或微生物蛋白，主要是指酵母菌、细菌、放线菌、藻类等单细胞微生物利用工农业废气、废水、农副产品下脚料、有机垃圾等为营养基质， 在人工控制条件下培养得到的菌体蛋白质。菌体蛋白中蛋白质含量丰富，高达40% ~ 80%，且氨基酸种类齐全，因此常作为蛋白饲料的主要来源。 目前， 我国的蛋白饲料基本都是采用微生物发酵所得（王宇灵等，2019；赵彩艳等，2019； 刘雪莲等，2009；Brahim，2005；Margareth，2001）。果渣中营养物质含量丰富，却常被当做废弃物丢掉，这不仅造成资源浪费，还会污染环境。因此为实现废物的再利用，可将其作为菌体蛋白饲料的生产原料（潘雄等，2021；田志梅等，2019；胡聪等，2017）。为进一步开发菌体蛋白饲料的生产原料提供理论依据，本研究以梨废渣（包括梨皮和梨核）为原料，酿酒酵母为菌种进行发酵试验研究， 采用响应面设计法对发酵工艺条件进行优化，以期获得较高菌体蛋白含量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 梨：市售，梨皮切丝、梨核切块后，65 ℃烘干24 h，粉碎过40 目筛，干燥保存备用；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中国普通微生物菌种保藏管理中心； 酵母膏胨葡萄糖琼脂（YPD）的液体培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司； 尿素： 天津市致远化学试剂有限公司；硫酸铜：天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备 101-2HSB 电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；RHP-400 型高速多功能粉碎机： 浙江永康市荣昊工贸有限公司；ZWY-100H 恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；XFH-30L 高压蒸汽灭菌锅： 浙江新丰医疗器械有限公司；Kjeltec2300 全自动凯氏定氮仪：丹麦FOSS。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵种子液的制备 YPD 液体培养基的制备：称取培养基样品50 g，加热溶解于1000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

在无菌操作环境下，从酿酒酵母菌斜面上挑取一环，接种于YPD 液体培养基中，28 ℃、180 r/min摇床培养24 h， 采用血细胞计数法测定细胞数，将细胞浓度调整为1×108cfu/mL （刘倩男，2016；刘壮壮，2014）。

1.3.2 梨废渣固态发酵 称取10 g 梨废渣，20 mL蒸馏水于锥形瓶中， 并按试验设计加入一定量的尿素， 搅拌至分散均匀，121 ℃高压灭菌30 min后，备用。

取一定量的发酵种子液接种于梨废渣固态发酵培养基中，28 ℃恒温培养一定时间， 培养过程中适当搅拌，待发酵结束后将样品在45 ℃下鼓风烘干，粉碎后测定其粗蛋白质含量（寇慧等，2021；Dey，2016；Leite，2016）。

1.3.3 粗蛋白质含量的测定 凯氏定氮法： 准确称取1 g 烘干粉碎后的样品，置于消化管内，加入CuSO40.4 g、K2SO46 g、浓H2SO420 mL 后，将消化管置于红外线消化炉中，调节温度400 ℃，至消化液完全澄清并呈绿色。消化结束后，用蒸馏水将消化液转入100 mL 容量瓶并定容， 然后用移液管量取10 mL 稀释后的消化液至干净的消化管中， 放入凯氏定氮仪上进行蒸馏和吸收。 硼酸吸收后的样液用0.1 mol/L 的HCl 标准溶液进行滴定，当样液颜色由蓝色变为微红色时，即为滴定终点，记录HCl 消耗的体积。 同时做一试剂空白试验（除不加样品外，从消化开始操作完全相同），记录空白试验消耗HCl 标准溶液的体积。

式中：V1为试液消耗盐酸标准溶液的体积，mL；V2为试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积，mL；V3为吸取消化液的体积，mL；c为盐酸标准滴定溶液浓度，mol/L；0.0140 为1.0 mL 盐酸标准滴定溶液相当于氮的质量，g；6.25 为氮换算为蛋白质的系数。 菌体蛋白含量的计算：

菌体蛋白含量/%=X×X1；

式中：X为发酵后梨废渣培养基中的蛋白质含量，%；X1为发酵前梨废渣培养基中蛋白质含量，%。

1.3.4 单因素试验设计（孙东立等，2021；怀宝东等，2020；黄裴，2017）。

1.3.4.1 尿素添加量对菌体蛋白含量的影响 梨废渣培养基中尿素添加量分别为5%、6%、7%、8%、9%，酿酒酵母接种量为5%（V/m），28 ℃恒温发酵3 d，搅拌3 次，发酵结束后测定粗蛋白质含量。

1.3.4.2 接种量对菌体蛋白含量的影响 梨废渣培养基中尿素添加量为7%， 酿酒酵母的接种量分别为1%、3%、5%、7%、9%，28 ℃恒温发酵3 d，搅拌次数为3 次，发酵结束后测定粗蛋白质含量。1.3.4.3 搅拌次数对菌体蛋白含量的影响 梨废渣培养基中尿素添加量为7%， 酿酒酵母接种量为5%，28 ℃恒温发酵3 d，搅拌次数分别为1、2、3、4、5 次，发酵结束后测定粗蛋白质含量。

1.3.4.4 发酵时间对菌体蛋白含量的影响 梨废渣培养基中尿素添加量为7%， 酿酒酵母接种量为5%，28 ℃恒温发酵时间分别为1、2、3、4、5 d，搅拌次数为3 次，发酵结束后测定粗蛋白质含量。

1.3.5 响应面优化试验设计 在单因素试验的基础上，以菌体蛋白含量为响应值，对影响菌体蛋白含量的尿素添加量、接种量、搅拌次数和发酵时间4 个因素的3 个水平进行响应面优化试验， 确定最佳发酵工艺条件，因素水平编码见表1。

表1 响应面试验因素水平及编码

1.4 数据处理 采用响应面分析软件Design-Expert 12.0 的Box-Behnken 中心组和原理进行试验设计和数据分析。 采用OriginPro 8.5.1 软件进行数据统计分析，每次试验重复3 次，数据表示为“平均值±标准差”形式。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 尿素添加量对菌体蛋白含量的影响 氮源在酵母菌的生长中是不可或缺的， 试验中采用尿素这一常用氮源。由图1 可知，随着尿素添加量的增加，菌体蛋白含量逐渐增加。原因可能是适量的氮源供给有利于微生物的生长繁殖， 也有利于微生物在细胞内合成氨基酸和碱基， 进而合成蛋白质。 当尿素添加量为8%时，菌体蛋白含量最高为5.49%。 当继续增大尿素添加量时，菌体蛋白含量呈下降趋势， 原因可能是发酵后期可利用碳源逐渐减少，造成碳氮比不合理，使微生物的生长受到抑制， 也可能是未被利用的尿素水解释放出NH4+，使得发酵环境的pH 改变，菌体生长受到影响，从而使菌体蛋白含量下降。故选择尿素添加量为8%为宜。

图1 尿素添加量对菌体蛋白含量的影响

2.1.2 接种量对菌体蛋白含量的影响 适当的接种量有利于菌体的生长， 培养基营养成分的合理利用及产物的生成。 由图2 可知，菌体蛋白含量随接种量的增大呈先上升后下降的趋势，当菌体接种量为5%时， 菌体蛋白含量最大，为5.03%。 分析原因可能是接种量较低时，发酵底物充足，但利用营养物质的微生物数量有限，使发酵底物得不到充分有效地利用， 因而菌体蛋白含量较低。 另外接种量较小，发酵菌种不能成为优势菌种，还会导致杂菌的生长繁殖，也会对发酵不利；接种量较大时，营养物质消耗迅速，使微生物生长过于旺盛， 释放大量的代谢热导致周围环境温度升高，使菌体失活甚至死亡，同时代谢废物也会大量积累， 这都不利于微生物的生长及蛋白的积累，导致菌体蛋白含量下降。故选择接种量为5%为宜。

图2 接种量对菌体蛋白含量的影响

2.1.3 搅拌次数对菌体蛋白含量的影响 搅拌次数的多少会影响锥形瓶中氧气的多少， 即影响到培养基中溶氧的大小。由图3 可知，菌体蛋白含量随搅拌次数的增大呈先上升后下降的趋势。 当搅拌次数为3， 产生的菌体蛋白含量最大，为5.42%。 分析原因可能是搅拌次数的增大会提高发酵过程的溶氧量。 酿酒酵母为兼性厌氧菌，但厌氧菌在有氧气的条件下会生长更好， 因为在厌氧条件下，所产生的乙醇不能进一步代谢，而在好氧条件下，一旦糖已全被耗尽，酵母菌就重新利用它们所产生的的乙醇并把它氧化成二氧化碳和水。 即好氧条件下利用一定量的糖比厌氧条件下获得更高的酵母菌量。但若搅拌次数过多，会对菌体细胞产生损伤，不利于菌体生长繁殖。因此选择最适的搅拌次数为3 次。

图3 搅拌次数对菌体蛋白含量的影响

2.1.4 发酵时间对菌体蛋白含量的影响 发酵时间是影响菌体蛋白含量的重要因素， 发酵时间过短， 使培养基中的营养物质得不到有效充分的利用， 菌体生物量累积不足， 达不到理想的发酵目的；而发酵时间过长，营养物质会被大量消耗，造成营养不足，引起微生物的内源消耗，从而导致菌体自溶死亡，降低发酵产量，还容易滋生杂菌。 另外，发酵周期过长还会增加设备等运行维护成本。由图4 可知，随发酵时间的延长，菌体蛋白含量呈先增长后下降的趋势。当发酵时间为3 d 时，菌体蛋白含量最大，为5.30%，且此时培养基无不良气味及孢子的产生，所以发酵时间选择3 d 为宜。

图4 发酵时间对菌体蛋白含量的影响

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计与结果 以尿素添加量、接种量、搅拌次数、发酵时间为自变量，菌体蛋白含量为响应值， 进行梨废渣发酵菌体蛋白响应面方案设计， 试验结果见表2。 将所得数据采用Design Expert 12.0 软件进行多元拟合回归分析，得到二次回归方程：Y=5.65+0.2408A+0.2242B+0.1317C+0.1217D+0.16AB+0.0425AC+0.035AD-0.1325BC-0.06BD-0.195CD-0.4674A2-0.3349B2-0.3812C2-0.2162D2，相关系数R2=0.9668，说明有96.68%的数据可用此模型来进行表示，模型拟合度较好。

表2 响应面试验设计及结果

根据表3 回归模型方差分析可知，模型的P＜0.0001，为极显著，说明该方程能够准确反映菌体蛋白含量与各因素之间的关系。 失拟项的P＞0.05， 为不显著， 说明模型与试验的拟合程度良好，差异值较小。 根据F 值和P值大小可知，各因素对菌体蛋白含量的影响顺序依次为A＞B＞C＞D，即尿素添加量＞接种量＞搅拌次数＞发酵时间。

2.2.2 双因素交互分析 由表3 方差分析可知，尿素添加量和接种量以及搅拌次数和发酵时间的交互作用达到极显著水平（P＜0.01），说明其交互作用对菌体蛋白含量影响极显著。 接种量和搅拌次数的交互作用对菌体蛋白含量影响显著 （P＜0.05）。 为更直观形象的说明因素间的交互作用对响应值的影响，利用Design-Expert 12.0 软件做交互项的响应面图和等高线图，如图5 所示。

表3 回归模型方差分析

响应面图越陡峭、弧度越大，说明该因素对响应值的影响越明显，反之亦然。 从图5 可知，尿素添加量和接种量的曲线相对于搅拌次数和发酵时间的曲线较陡， 说明尿素添加量和接种量对菌体蛋白含量影响显著。 接种量曲线比搅拌次数的曲线陡峭，且沿着接种量变化，等高线相对密集，说明接种量的影响比搅拌次数的影响大。 等高线图可以依据其图形的形状来判断其交互影响的程度，图形为椭圆则说明交互现象明显，反之亦然。从图5 可知，三组图形均呈扁平椭圆状，说明它们对菌体蛋白含量的影响均显著。 其中搅拌次数和发酵时间的交互作用最强， 其次是尿素添加量和接种量以及接种量和搅拌次数， 这些都与回归方程的方差分析结果一致。

图5 不同影响因素交互作用的响应面图和等高线图

2.2.3 最佳发酵工艺条件的确定 通过软件进一步分析得出菌体蛋白的最佳发酵条件为：尿素添加量8.426%，接种量6.025%，搅拌次数3.021 次，发酵时间3.356 d，此时菌体蛋白含量为5.64%。 考虑到实际情况，将最终的发酵工艺条件修正为：尿素添加量8.4%，接种量6%，搅拌次数3 次，发酵时间3.35d，并在此条件下进行试验验证，重复试验3 次取平均值，得到实际的菌体蛋白含量为5.62%。 该实际值与预测值相近，相对误差仅为0.35%，说明由Box-Behnken 试验设计所得的菌体蛋白的最佳发酵工艺条件准确可靠，具有可行性。

3 结论

本研究以梨废渣为原料，酿酒酵母为菌种生产菌体蛋白，通过采用响应面分析法对发酵工艺进行优化。 在单因素试验基础上，以菌体蛋白含量为响应值，对尿素添加量、接种量、搅拌次数和发酵时间4 个因素进行Box-Behnken 试验设计及优化。研究表明， 各因素对菌体蛋白含量的影响均极显著，影响顺序依次为尿素添加量＞接种量＞搅拌次数＞发酵时间。 通过双因素交互分析，得出尿素添加量和接种量以及搅拌次数和发酵时间的交互作用达到极显著水平，对菌体蛋白含量影响极显著。 优化得出的最佳发酵条件为： 尿素添加量8.4%， 接种量6%，搅拌次数3 次，发酵时间3.35 d，在此条件下产生的菌体蛋白含量为5.62%。 该研究为进一步开发菌体蛋白饲料生产原料提供理论基础。