一株高产中性蛋白酶菌株的筛选与诱变

卢 超 ， 陈景鲜， 王国霞， 李春阁， 林 展， 苏芳谊， 张 苗

（1.郑州师范学院生命科学学院，河南郑州450000；2.福建医科大学药学院，福建福州350004）

中性蛋白酶作为工业酶制剂之一， 在食品工业、洗涤液、皮革制造业以及医疗行业等领域中均有广泛的应用（李雪等，2019）。目前我国使用中性蛋白酶的生产菌种主要包括芽孢杆菌、变形杆菌、青霉、曲霉、放线菌等（冯菲等，2021；赵龙妹等，2020）。但直接筛选出的原始产蛋白酶的菌株产酶能力较低，无法满足工业化的需求，因此，需对菌株进行处理， 以增强菌株产蛋白酶的能力。 目前提高菌种产酶能力的方法很多，如使用紫外线、粒子束， 以及各种射线的物理诱变方法； 碱基类似物、烷化剂等各种化学诱变方法（高紫等，2021；高若珊等，2021；季旭等，2021；君胡荣等，2019）。 这些物理和化学方法不需要昂贵的大型仪器， 是目前采用最普遍的诱变方法（Yu 等，2019）。 胡悦等（2019）在氯化锂添加量为1.5%、常压室温等离子体照射时间为45 s 的诱变条件下筛选得到地衣芽孢杆菌菌株F-3， 该菌株碱性蛋白酶的酶活达到12147 U/mL（胡悦等，2021）。 黄子凌等（2021）以紫外、氯化锂为诱变剂，在经过3 轮诱变后，得到了一株表现良好抑菌和益生特性， 且稳定高产中性蛋白酶的突变菌株UL-191，其中性蛋白酶活达108.812 U/mL，较出发菌株提高了44.2%。

本试验通过牛奶平板筛选， 多次划线从土壤中筛选得到一株产蛋白酶的菌株L01， 福林酚方法测定其酶活。 分别用紫外线和亚硝酸钠进行单因素处理，以提高该菌株中性蛋白酶酶活。随后用紫外线和亚硝酸钠进行复合处理测定其发酵液的酶活。 筛选出中性蛋白酶酶活最高的菌株经过10次以上的传代探索其遗传稳定性。 最后通过分子生物学方法鉴定筛选出高产中性蛋白酶的菌株。本研究为采用该菌株生产中性蛋白酶的后续研究及应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 细菌基因组DNA 提取试剂盒、真菌基因组DNA 提取试剂盒、引物合成，生工生物工程（上海）股份有限公司；Tks Gflex DNA 聚合酶，宝生物工程（大连）有限公司；其他试验所用常规试剂为市售分析纯。

牛奶平板培养基：50%脱脂牛奶，1%琼脂溶于50%无菌水中，121 ℃灭菌20 min， 温度降至50 ℃左右混合均匀制作牛奶平板。 酪蛋白平板培养基：0.5%酪蛋白，0.2%磷酸氢二钠，1%琼脂，121 ℃灭菌20 min，温度降至50 ℃左右混合均匀制作酪蛋白平板。 YPD 液体培养基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，121 ℃灭菌20 min，温度降至50 ℃左右混合均匀。 LB 培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化钠，121 ℃灭菌20 min，温度降至50 ℃左右混合均匀。

1.2 仪器与设备 立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；超净工作台：上海一恒科学仪器有限公司；pH 计：瑞士梅特勒托利多集团；高速离心机：德国Eppendorf 公司；恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司； 紫外分光光度计： 德国Eppendorf 公司；磁力搅拌器：上海一恒科学仪器有限公司；分析天平：瑞士梅特勒托利多集团。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株筛选 土壤采自郑州师范学院西校区4 号楼北面树林，选取地下10 ~ 20 cm 土样3 g 于100 mL 水中混匀， 放在培养箱中30 ℃振荡1 h 使充分混匀。 取培养后的菌液1 mL 至9 mL 无菌水中，制成10-1倍菌液，按照上述方法，制成10-4、10-5、10-6倍菌液，将几种稀释后的菌液分别涂布于牛奶平板培养基和酪蛋白平板培养基上，放在培养箱中30 ℃培养24 h。 挑出有明显透明圈的菌种在相同培养基上进行反复划线处理，根据透明圈是否容易观察选择合适平板培养基。观察透明圈和菌落直径大小，测量透明圈直径/菌落直径，即H/C 值，作为初筛评价各菌株产蛋白酶的能力。

挑选透明圈明显且H/C 值较大的菌株进行复筛。 将挑选出来的产酶菌种分别加到LB 和YPD 培养基中，30 ℃、150 r/min 培养24 h。 根据菌液24 h 内OD600变化快慢选择合适的液体培养基，取24 h 的培养液进行蛋白酶活力测定。

1.3.2 蛋白酶活力检测方法 参考卢超等(2020）试验方法，取新鲜发酵液于4 ℃，8000 r/min 条件下离心8 min，吸取上清作为活性检测的粗酶液。按照GB/T23537-2009《蛋白酶制剂》，利用福林-酚法测定酶活力。

1.3.3 单因素诱变处理 紫外线诱变处理： 超净台紫外灭菌30 min 后，用灭菌针头蘸取稀释后的菌悬液在红灯下分别在牛奶平板培养基上点板处理。对照组点板之后不做任何处理；试验组在预试验中确定时间间隔为12 s， 完全暴露在功率20 W的紫外灯下20 cm 处，分别照射12、24、36、48、60、72、84 s。 处理后置于恒温培养箱中30 ℃培养24 h。测量每个培养基上所有菌落的H/C 值，挑选出H/C值最大的4 个菌落，分别放入LB 培养基，在振荡培养箱中，30 ℃、150 r/min 培养24 h 测酶活力。

化学试剂诱变处理： 取初筛出的菌悬液稀释20 倍，后取0.2 mL 稀释液加入等量0.1 moL 亚硝酸钠溶液，由预试验得出诱变时间间隔是2 min，从6 min 开始处理，分别处理6、8、10、12、14、16 min后，分别加入0.2 mL 的等浓度磷酸氢二钠溶液混匀。 空白对照组将亚硝酸钠替换成生理盐水。 处理后的菌液在牛奶平板培养基上进行点板， 置于恒温培养箱中30 ℃避光培养24 h。 测量每个培养基上所有菌落的H/C 值，挑选出H/C 值最大的4 个菌落，分别放入LB 培养基，在振荡培养箱中，30 ℃、150 r/min 培养24 h 测酶活力。

1.3.4 复合诱变处理 先紫外再化学处理： 首先用灭菌牙签蘸取稀释20 倍后的菌悬液在红灯下分别在牛奶平板培养基上点板处理。 置于超净台上完全暴露在功率20 W 的紫外灯下， 分别照射36、48、60 s， 同时以未经紫外诱变处理的作为对照组，处理后置于恒温培养箱中30 ℃避光培养8 h。其次， 在离心小管中加入0.2 mL 的亚硝酸钠溶液， 用灭菌牙签蘸取紫外诱变后的菌分别放入亚硝酸钠溶液中， 分别诱变8、10、12 min 后加入磷酸氢二钠溶液。 对照组以生理盐水代替亚硝酸钠溶液。 蘸取诱变后的菌液及对照组在牛奶平板上进行点板，置于恒温培养箱中30 ℃避光培养24 h。测量每个培养基上所有菌落的H/C 值， 挑选出H/C值最大的3 个菌落，分别放入LB 培养基，在振荡培养箱中，30 ℃、150 r/min 培养24 h 测酶活力。

先化学再紫外处理：取0.2 mL 稀释液加入等量0.1 mol 亚硝酸钠溶液混匀，分别处理8、10、12 min 后，各加入0.2 mL 的等浓度磷酸氢二钠溶液。对照组以生理盐水代替亚硝酸钠溶液。化学诱变后的菌液在制备好的牛奶平板培养基上进行点板。 点板之后将其置于已灭菌的超净台上完全暴露在功率20 W 的紫外灯下，分别照射36、48、60 s，同时以未经紫外诱变处理的作为对照组。 盖上培养基盖子并做好相应标记，于恒温培养箱中30 ℃避光培养24 h。 测量每个培养基上所有菌落的H/C值，挑选出H/C 值最大的3 个菌落，分别放入LB培养基， 在振荡培养箱中，30 ℃、150 r/min 培养24 h 测酶活力。

1.3.5 菌株稳定性研究 将挑选出的菌株进行酶活测定后， 从这6 个菌株中挑选出酶活最大的3个菌株进行稳定性研究。 将3 个菌株接种到LB培养基中， 在振荡培养箱中以30 ℃、150 r/min 培养24 h 后测蛋白酶酶活， 依次连续传代培养10次，并用福林-酚法测定中性蛋白酶酶活力。

1.3.6 菌种的鉴定 利用细菌基因组DNA 提取试剂盒和真菌基因组DNA 提取试剂盒分别提取菌种基 因 组DNA。 利 用 通 用 引 物27F （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’） 和1492R （5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’） 扩增细菌基因组DNA 提取试剂盒提取产物， 通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）扩增真菌基因组DNA 提取试剂盒提取产物。 PCR 采用Tks Gflex DNA 聚合酶，25 μL 扩增体系。扩增程序为94 ℃变性1 min，98 ℃变性10 s，60 ℃复性15 s，68 ℃延伸50 s，30 个循环。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并将其产物送上海生工进行测序。 测序结果在NCBI 中进行BLAST 分析，然后用MEGA 7.0 软件进行序列相似性分析， 以N-J 法构建系统发育树，用Bootstrap（1000 次重复）进行检验。

2 结果与分析

2.1 培养基筛选结果 用牛奶平板和酪蛋白平板两种培养基涂板之后进行培养。通过菌种在两种平板上生长情况的对比发现，菌种在牛奶平板上生长的更快，H/C 值相对较大更容易观察， 另外牛奶平板在配制的时候更方便，因此最终选择用牛奶平板进行后续试验。 挑选出的单菌落在LB 培养基中生长更快，因此液体培养基选择LB 培养基。 将挑选出的出发菌株标记为L01，进行后续试验。

2.2 紫外线及亚硝酸钠单因素处理结果

2.2.1 紫外线处理结果 由图1 数据可知， 在相同紫外照射的时间下，L01 菌株表现出不同的H/C 值，一部分H/C 值增大，呈现正突变，一部分H/C 值增大，呈现负突变。 从整体上来说，L01 菌株H/C 值在0 ~ 60 s 处理时间段内呈现稳步增加的趋势，在60 s 时菌株H/C 值有最高点，而H/C 值在60 ~ 84 s 处理时间段内呈现快速下降的趋势。这可能是由于紫外线照射时间较长后引起菌株的死亡，因此L01 菌株紫外线处理的最佳诱变时间为60 s，H/C 值最大为2.75。

图1 紫外线处理后H/C 值结果

2.2.2 亚硝酸钠处理结果 由图2 数据可知，从整体上来说，L01 菌株H/C 值在经亚硝酸钠处理0 ~12 min 处理时间段内呈现稳步增加的趋势， 在12 min 时菌株H/C 值有最高值， 而H/C 值在12~16 min 处理时间段内呈现快速下降的趋势。 而在亚硝酸钠处理6 min 时，L01 菌株的H/C 值呈现正突变和负突变同时存在的情况。 相比紫外线处理而言，L01 菌株经亚硝酸钠处理后的H/C 值表现出更集中的趋势。L01 菌株亚硝酸钠处理的最佳时间诱变时间为12 min，H/C 值最大为2.76。

图2 亚硝酸钠处理后H/C 值结果

2.2.3 单因素处理菌株酶活测定结果 分别对单因素处理24 h 后的菌落，挑取H/C 值极大值的菌落，用LB 培养基进行摇菌培养，培养24 h 后进行酶活测定，测定结果如表1 所示。紫外线处理时间从0 ~ 60 s，H/C 值从1.75 增加到2.75，L01 菌株中性蛋白酶活力从221.45 U/mL 增加到459.13 U/mL。 这与亚硝酸钠处理结果类似，亚硝酸钠处理时间从0 ~ 12 min，L01 菌株中性蛋白酶活力增加到459.13 U/mL。 由表1 数据可发现，紫外线或亚硝酸钠处理后L01 菌株的H/C 值与酶活力测定结果成正比，说明利用H/C 值初筛中性蛋白酶活力的方法是可行的。

表1 单因素处理菌株酶活测定结果

2.3 复合诱变2 因素3 水平测定结果

2.3.1 先紫外后亚硝酸钠处理结果 由图3 试验数据可知， 先紫外后亚硝酸钠复合处理的9 个组合，各组合的H/C 值差异较大，最低的H/C 值为1.23，出现在先紫外处理60 s 后亚硝酸钠处理12 min 的组合， 这可能由于复合诱变时间太长导致菌体死亡。 最高的H/C 值为3.00，其处理时间为先紫外处理48 s 后亚硝酸钠处理8 min 的组合，以及先紫外处理48 s 后亚硝酸钠处理12 min 的组合，但48 s+10 min 的组合，其H/C 的均值是9个组合中最高，为2.25。

图3 先紫外后亚硝酸钠处理结果

2.3.2 先亚硝酸钠后紫外处理结果 由图4 试验数据可知， 先亚硝酸钠后紫外复合处理的9 个组合，12 min+48 s 和12 min+60 s 两个组合的H/C值差异较大， 其余7 个组合的H/C 值差异较小，但较集中。 最高的H/C 值为4.00，其处理时间为先亚硝酸钠处理12 min 后紫外处理48 s 的组合，且12 min+48 s 的处理组合，其H/C 值的均值是9 个组合中最高，为2.48。

图4 先亚硝酸钠后紫外处理结果

2.3.3 复合处理菌株酶活测定结果 复合诱变之后分别挑取H/C 值极大值的菌落，诱变时间分别是36 s+12 min，48 s+8 min，48 s+12 min，8 min+48 s，12 min+48 s，12 min+60 s 的菌落用LB 培养基进行摇菌培养， 培养24 h 后进行酶活测定，测定结果如表2 所示。

表2 复合处理菌株酶活测定结果

结合表1 和表2 试验数据可知，L01 菌株进行单因素诱变之后， 将筛选出的产中性蛋白酶菌株进行酶活测定， 测定菌株的最大产酶能力是459.13 U/mL，L01 菌株进行复合诱变之后， 筛选出的产中性蛋白酶菌株进行酶活测定，结果表明，最大产酶酶活为577.87 U/mL。 表明复合诱变最大值优于单因素诱变效果。由表2 试验数据可知，在进行最优产酶菌株筛选时，先亚硝酸钠后紫外的复合处理优于先紫外后亚硝酸钠的复合处理方法。在12 min+48 s 的诱变方法下，L01 菌株的最大产酶酶活为577.87 U/mL，较出发菌株的221.45 U/mL提高了158.87%。

2.4 菌株的稳定性研究结果 将在复合诱变中筛选出产中性蛋白酶酶活最大的3 个菌株再次用LB 平板划线后挑出单菌落，用LB 培养基进行摇菌培养，每隔培养24 h 后进行酶活测定，这3 个菌株经过连续10 次传代， 测定结果如表3 所示。由表3 试验数据可知， 每次测量的中性蛋白酶酶活较前一次菌株保留98%以上，具有良好的遗传稳定性。 最后，将利用12 min+48 s 的诱变方法筛选出菌株标记为L01F，进行后续菌种鉴定。

表3 菌种遗传稳定性研究U/mL

2.5 菌种鉴定结果 LB 固体平板上L01F 菌株的菌落形态为扁平、表面光滑、边缘不规则、半透明状， 显微镜下的革兰氏染色结果表明菌体为长杆状、染色均匀，可观察到孢子产生，因此为革兰氏阳性芽孢杆菌。为进一步确定种属，分别利用真菌基因组DNA 提取试剂盒和细菌基因组DNA 提取试剂盒提取筛选的L01F 菌株基因组DNA。 直接以提取产物为模板分别用真菌通用引物ITS1/ITS4 和细菌通用引物27F/1492R 进行PCR 扩增。PCR 电泳结果如图5 所示。

图5 特异引物PCR 产物电泳

由图5 电泳结果可知， 泳道1 的真菌通用引物ITS1/ITS4 未扩增出任何特异性条带，而泳道2的细菌通用引物27F/1492R 扩增产物在1.5 kb左右处有明亮的特异性条带产生， 随后将该特异性条带进行切胶纯化并送到上海生工进行测序。将测序结果上传至NCBI 进行BLAST 检索，用MEGA 7.0 软件进行序列相似性分析， 以N-J 法构建系统发育树，聚类分析结果如图6 所示。结合前面形态鉴定、革兰氏染色、分子生物学和系统发育进化树结果， 可确定菌株L01F 属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

图6 菌株L01F 系统发育进化树

3 结论

本试验从土壤中筛选一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌， 利用单因素和复合诱变方法提高菌株的产酶能力。通过牛奶平板筛选，多次划线得到一株产蛋白酶的菌株，编号L01，福林酚方法测定其酶活力为221.45 U/mL。 分别用紫外线和亚硝酸钠进行单因素处理，紫外线照射60 s 和亚硝酸钠处理12 min 时候，菌株L01 的H/C 值达到最大（2.75），其酶活力为459.13 U/mL。 单因素处理后的酶活是原始菌株的2.07 倍。 复合处理结果显示复合诱变结果优于单因素诱变效果， 而先亚硝酸钠后紫外的复合处理优于先紫外后亚硝酸钠的复合处理方法。 在12 min+48 s 的诱变方法下，L01 菌株的的H/C 值达到最大（4.00），最大产酶酶活力为577.87 U/mL，编号为L01F 菌株的酶活力是原始菌株的2.61 倍。 经过10 次以上的传代，L01F 菌株表现出良好的遗传稳定型。最后经过形态学和分子生物学鉴定，确定筛选出的菌株L01F为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。本研究对产中性蛋白酶菌株的筛选、 相关菌株的产酶能力提高和菌种的诱变选择具有重要意义。