基于添加物调控提高那西肽发酵效价

李德才,华 骏,周 扬,赵世光,薛正莲

(安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽芜湖 241000)

基于添加物调控提高那西肽发酵效价

李德才,华 骏,周 扬,赵世光∗,薛正莲

(安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽芜湖 241000)

研究不同添加物对活跃链霉菌产那西肽发酵过程的影响,以提升那西肽发酵效价．以单因素实验考察7种添加物对那西肽发酵效价的影响,研究其各自的较优添加水平及添加时间;综合单因素实验结果,以那西肽效价为指标,采用响应面法对硫酸锰、硝酸镧、硝酸铈的添加浓度进行优化．供试添加物均不同程度提升了那西肽发酵水平,提升效果依次为EDTA＞硫酸锰＞硝酸铈＞橄榄油＞硝酸镧＞壳聚糖＞制霉素．分别在发酵24 h添加9．27μg/L硫酸锰,96 h添加5．15μmol/L硝酸镧和0．9 mmol/L硝酸铈,那西肽发酵效价达到948.08μg/m L,比优化前提高了30．97%．基于添加物调控策略可有效提升那西肽发酵效价．

活跃链霉菌;添加物调控;那西肽;响应面法

那西肽,是由活跃链霉菌(Streptomyces actuosu)产生的含硫肽脂类抗生素[1],对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌均具有抑菌活性[2]．那西肽为属胞内次级代谢产物,仅有部分那西肽可通过细胞膜渗透到发酵液中[3]．活跃链霉菌代谢过程中,胞内那西肽的大量累积会对其关键合成酶产生反馈抑制或反馈阻遏,因此,正常条件下活跃链霉菌无法大量分泌那西肽．

研究表明,采用超声、微波介入等物理手段均可不同程度改善微生物细胞膜或细胞壁的通透性,可有效减弱微生物代谢过程中产物的反馈抑制作用．发酵过程中添加特定的化学物同样可改善细胞透性,提高发酵单位．如添加抗生素能够与霉菌细胞膜中的甾醇相结合,可改善细胞膜通透性[4];添加脂肪酸则能拮抗脂肪酸的生物合成,导致磷脂合成不足,损伤细胞膜结构,增大其透性[5];添加金属离子[6-8]可引发化学沉淀,破坏细胞壁、细胞膜以及细胞间隙的结构,增大通透性,利于产物释放;金属离子螯合剂则能有效结合细胞壁中的钙离子,破坏细胞壁[9]．多项研究表明[10-11],基于添加物调控策略的发酵过程控制可不同程度改善微生物细胞膜或细胞壁的通透性,有效减弱微生物代谢过程中产物的反馈抑制作用,提高微生物代谢产物的发酵单位活产量．

以单因素实验研究不同添加物及其添加时机对活跃链霉菌产那西肽发酵过程的影响．采用响应面设计法对添加物浓度进行优化,以期为提高那西肽发酵水平及其工业化生产提供理论基础．

1 材料与方法

1．1 菌株

活跃链霉菌(Streptomyces actuosu),安徽工程大学生物与化学工程学院保藏．

1．2 培养基

斜面培养基(%):FeSO4·7H2O 0.001、NaCl 0.05、KNO30.1、MgSO4·7H2O 0.05、K2HPO4·3H2O 0.05、豆饼粉0.5、可溶性淀粉2、琼脂2,p H自然．121℃灭菌20 min．

种子培养基(%):MgSO4·7H2O 0．05、(NH4)2SO40．3、玉米浆2．0、葡萄糖3、豆饼粉2．0、轻质碳酸钙0．5,p H 6．5．115℃灭菌25 min．

发酵培养基(%):KNO30．05、(NH4)2SO40．1、NaCl 0．4、黄豆粉4．0、酵母0．2、葡萄糖0．5、淀粉酶(淀粉的0．1%)、淀粉7．0、轻质碳酸钙0．4,p H 7．0．115℃灭菌25 min．

1．3 培养方法

从活化的新鲜斜面切取黄豆大小的菌落接入种子培养基(40 m L/500 m L),260 r/min、28℃培养40 h后,按照200μL/1．5 m L接种量接入发酵培养基,260 r/min、28℃培养144 h．发酵培养在24孔微孔板中进行．

1．4 不同添加物对活跃链霉菌产那西肽效价的影响

选取制霉素、橄榄油、壳聚糖、硝酸镧、硝酸铈、EDTA和硫酸锰7种化学添加物,配置适当质量浓度的母液,添加物添加梯度质量浓度对照如表1所示．按照表1的梯度质量浓度于96 h分别添加到发酵液中,发酵结束后,分别测定那西肽效价,考察不同表面活性物质及其添加质量浓度对那西肽效价的影响．

表1 添加物添加梯度质量浓度对照表

1．5 添加时间对活跃链霉菌产那西肽效价的影响

选取上述添加物,在其最优质量浓度下,分别于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h添加至发酵液中,发酵结束后,分别测定那西肽效价．

1．6 添加物添加质量浓度响应面优化

综合文献资料及单因子实验结果,采用3因素3水平响应面法对硫酸锰、硝酸铈及硝酸镧添加质量浓度进行优化．响应面设计因素及水平如表2所示．

表2 响应面设计因素及水平表

1．7 那西肽产量的测定

分光光度计法测定那西肽效价[12-13]:取发酵液5 m L(含菌丝体)于10 m L离心管中,加入5 m L无水乙醇,摇匀后放入37℃恒温水浴中保温45 min,离心,取上清液0．5 m L,于另一10 m L离心管中,加入5 m L硼酸缓冲液和4 m L正丁醇溶液,充分摇匀,于37℃水浴中静置20 min,取上清液2 m L,加无水乙醇2 m L,摇匀测定OD408nm．当OD值≤0．5时,效价＝OD×2×1088;当OD值＞0．5时,取发酵液5 m L,加入无水乙醇10 m L,同上法操作,效价＝OD×3×1088．

2 结果与讨论

2．1 不同添加剂对活跃链霉菌产那西肽发酵的影响

EDTA、橄榄油、硝酸铈、硝酸镧、制霉素、壳聚糖、硫酸锰对活跃链霉菌产那西肽的影响如图1～图7所示．由图1～图7可知,活跃链霉菌发酵过程中,不同的化学添加物均影响那西肽的产量,那西肽效价呈现不同程度的浓度依赖性,且存在最适添加浓度．总体上表现出低浓度促进,高浓度抑制．原因在于:低浓度添加物对细胞膜、细胞壁造成损伤,可增加细胞壁或细胞膜的通透性,有效提高那西肽的渗出,解除活跃链霉菌发酵过程的反馈作用;而添加物浓度过高,可导致细胞损伤过度或死亡,抑制活跃链霉菌的生长,反而不利于那西肽的合成．不同添加剂对活跃链霉菌产那西肽发酵的影响如图8所示．由图8可知,各添加物在最适添加剂量下,那西肽合成效价存在显著差异．不同添加物对那西肽发酵效价提升效果依次为EDTA＞硫酸锰＞硝酸铈＞橄榄油＞硝酸镧＞壳聚糖＞制霉素．

有研究表明,EDTA为金属离子螯合剂,能结合细胞壁中的钙离子[14],而橄榄油也可与金属离子结合形成脂肪酸盐,发酵过程中同时添加二者及金属离子后,有可能削弱镧、铈金属离子对那西肽效价的提升作用．综合考虑添加物多因素优化实验需要,选择硫酸锰、硝酸铈和硝酸镧进行下一步研究．

2．2 添加剂添加时间对活跃链霉菌产那西肽的影响

为考察化学添加物的加入时机对活跃链霉菌产那西肽发酵的影响,分别在0～144 h发酵周期内定时加入各最适浓度的添加物,测定那西肽效价,结果如图9所示．由图9可知,各添加物添加时机的不同会显著影响那西肽的合成．过早及过迟添加均不利于那西肽合成,存在不同的最适加入时机．硫酸锰、硝酸镧和硝酸铈分别在发酵24 h、96 h和96 h添加为最佳．且那西肽效价达到峰值时,表现出添加物对其合成促进效果依次为硫酸锰＞硝酸铈＞硝酸镧．推测原因在于铈和镧对活跃链霉菌的毒性较大,较早地加入到发酵液中可能破坏细胞组织,使菌体不能大量的繁殖,导致那西肽在发酵结束时产量较低,而锰离子可能参与细胞结构的组成,不仅能增大细胞膜的通透性,同时也参与菌体自身的生长,促进效果较为显著．

由图9还可以看出,同一时间点不同添加物对活跃链霉菌产那西肽发酵的效价也存在差异性．表现出在发酵前期(0～72 h)硫酸锰对那西肽产量的促进作用优于硝酸镧、硝酸铈,而在后期(72～120 h)其对那西肽产量促进效果则依次为硝酸铈＞硝酸镧＞硫酸锰．由此进一步说明不同金属离子在添加时间上存在差异性,且相对于硝酸铈和硝酸镧,硫酸锰则可能具有促进生长代谢和增大细胞膜透性的双重作用．

2．3 响应面实验结果

在单因素实验结果基础上,以硝酸铈(X1)、硝酸镧(X2)、硫酸锰(X3)为自变量,以那西肽效价(Y)为响应值进行响应面实验,实验结果如表3所示．

表3 响应面分析方案及实验结果

根据表3的实验结果,用Design-export软件对响应面实验进行分析,得到以那西肽效价(Y)为响应值的回归方程:

响应面ANOVA分析如表4所示．由表4可知,模型的Pr＞F＝0．0073,失拟项Pr＞F＝0．169 6,表明该模型回归性极显著,失拟不显著．相关系数R2＝0．954 7,表明相关性较好,校正相关系数R2adj＝0．873 0,说明响应面87．30%的数据变化可以由此模型解释,模型与实际情况拟合较好,因此可以用此回归方程代替各组实验对实验结果进行分析和预测．回归方程各项的方差分析结果表明,方程中X2,X1X1对Y值影响显著,X2X2对Y值得影响极显著,表明实验因素对响应值不是简单的线性关系,二次项对响应值也有很大的关系,交互作用的影响相对较小．这和模型回归中的线性和平方项显著相对应．

表4 响应面ANOVA分析

各因子交互作用的响应面3D直观图及等高线图如图10～图12所示．由图10、图11、图12可知,在控制单一因素不变的情况下,在一定范围内提高其他两种添加物浓度,那西肽产量不断提高,趋势逐渐平缓后又略有下降．那西肽效价在各因子所选范围内存在极大值．

为进一步确定最佳条件的值,对回归方程取一阶偏导数等于零．求解得X1＝0．900 602 mmol/L,X2＝75．147 49μmol/L, X3＝9．269 813μg/L．结合实验的实际操作,优化条件应进行修正,即得硝酸铈、硝酸镧、硫酸锰的最优添加浓度为0.90 mmol/L、75.15μmol/L、9.27μg/L．在此条件下,那西肽产量的理论最佳值为952.488μg/m L．为了验证上述条件的可行性,在该条件下发酵144 h后测定,得到那西肽效价为948.08μg/m L,与理论值相差0．46%．因此,响应面法对化学添加物促进活跃链霉菌产那西肽优化是可行的,得到的添加物添加条件具有实际应用价值．

3 结论

基于添加物调控策略,采用单因素实验结合响应面分析法,考察不同化学添加物对活跃链霉菌发酵产那西肽的影响,并对优选添加物进行优化．结果表明,化学添加物在一定浓度范围内能够有效提升细胞结构的通透性,增加那西肽的产量．添加物对那西肽发酵效价提升效果依次为EDTA＞硫酸锰＞硝酸铈＞橄榄油＞硝酸镧＞壳聚糖＞制霉素．响应面实验确定了发酵过程中分别在24 h、96 h和96 h添加浓度为9．27μg/L、75．15μmol/L、0．90 mmol/L的硫酸锰、硝酸镧和硝酸铈,对那西肽合成具有最大提升效果,那西肽效价达到948．08μg/m L,比优化前提高了30．97%．

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Improvement of nosiheptide fermentation titer by additives regulation

LI De-cai,HUA Jun,ZHOU Yang,ZHAO Shi-guang∗,XUE Zheng-lian
(Engineering Technology Research Center of Anhui Microbial Fermentation, Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Effects of different additives on the nosiheptide fermentation by Streptomyces actuosus were studied to enhance its titer．Single factor experimental method was used to study the effects of seven additives on nosiheptide fermentation titer as well as their proper adding time and concentration respectively．Resulting from single factor experiments,concentrations of MnSO4,La(NO3)3and Ce(NO3)3were optimized with response surface method with the nosiheptide titer as the indicator．All tested additives enhanced the level of nosiheptide fermentation in varying degrees with the order of EDTA＞MnSO4＞Ce(NO3)3＞Olive oil＞La(NO3)3＞Chitosan＞Nystatin．when MnSO4(9．27μg/L),La(NO3)3(75．15μmol/L)and Ce(NO3)3(0．9 mmol/L)were added for a period of 24 h,96 h and 96 h respectively,nosiheptide titer reached 948．08μg/m L,30．9%higher than that of initial．Additives regulation strategy effectively enhanced nosiheptide fermentation titer．

streptomyces actuosus;additive regulation;nosiheptide;response surface

TQP27

A

1672-2477(2015)04-0020-06

2015-02-16

安徽省高校自然科学基金资助项目(KJ2013A048);国家级大学生创新创业训练计划基金资助项目(201410363070,201410363025)

李德才(1987-),男,安徽芜湖人,硕士研究生．

赵世光(1977-),男,安徽芜湖人,副教授,博士．