生长期膳食缺锌小鼠肾细胞凋亡及机制研究

田娟，郭芳，李晓明

生长期膳食缺锌小鼠肾细胞凋亡及机制研究

田娟，郭芳，李晓明

目的观察膳食缺锌条件下生长期小鼠肾细胞凋亡情况、氧化应激情况及凋亡相关因子Bcl-2和Bax的表达变化，探讨锌缺乏诱发肾细胞凋亡的机制。方法将刚断乳雄性小白鼠30只随机分为缺锌组和足锌组，每组15只。缺锌组喂饲缺锌饲料（0.85 mg/kg），足锌组喂饲足锌饲料（30 mg/kg）。应用TUNEL法观察小鼠肾细胞凋亡情况，计算凋亡指数；分别应用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定肾超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量；应用蛋白印迹技术检测肾组织中Bcl-2、Bax蛋白表达变化。结果与足锌组比较，缺锌组小鼠肾可见TUNEL阳性细胞增多，细胞凋亡指数明显增加；抗氧化酶SOD活性下降，MDA增加，氧化应激反应增强；凋亡相关因子Bcl-2蛋白表达量明显下降，Bax蛋白表达量明显上调，Bcl-2/Bax比值下降。结论生长期膳食缺锌导致肾细胞抗氧化酶活性降低，氧化应激反应增强及细胞凋亡相关因子Bcl-2和Bax蛋白表达改变，最终导致肾细胞发生凋亡。

锌；细胞凋亡；肾；氧化性应激；bcl-2相关X蛋白质；缺锌

锌是机体内重要的微量元素，在体内分布广泛。锌的功能包括：参与多种酶和激素的合成，维持生物膜的结构、功能和上皮细胞的正常形态，调节机体的生长和发育等［1］。细胞凋亡是基因控制的细胞自主有序的死亡，以维持机体内环境稳定。研究表明，缺锌可导致机体脑、肝、肾、睾丸以及免疫系统的细胞发生凋亡［2-3］。特别是在生长期，缺锌可导致大鼠胸腺和睾丸细胞凋亡，甚至萎缩［4］。前期实验表明，生长期膳食缺锌可导致小鼠肾脏形态学改变和肾单位数目减少。为进一步观察锌离子对小鼠肾脏结构和功能的影响，本实验应用TUNEL法观察生长期缺锌小鼠肾细胞凋亡情况，并检测肾组织中氧化应激反应指标及凋亡相关蛋白的表达变化，探讨膳食缺锌引起肾细胞凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择刚断乳雄性清洁级小白鼠30只，体质量13～16 g，平均（14.27±0.85）g，由辽宁医学院实验动物中心提供［医动字第SCXY（辽）2003-2007号］。采用随机数字表法将其分为缺锌组和足锌组，每组15只。其中缺锌组喂饲缺锌饲料（0.85 mg/kg），足锌组喂饲足锌饲料（30 mg/kg）［5］。动物单笼喂养8周，自由饮用去离子水。

1.2 实验试剂兔抗小鼠B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）克隆抗体和兔抗小鼠Bcl-2相关X蛋白（Bax）多克隆抗体购自Santa cruz公司，原位缺口末端标记（TUNEL）试剂盒购自德国Roche公司，超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，细胞骨架蛋白（β-actin）鼠单克隆抗体购自上海康成生物工程有限公司，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、蛋白标志物购自美国NEB公司，底物化学发光（ECL）试剂盒购自美国Pierce公司。

1.3 标本制备将小鼠用水合氯醛麻醉，剖腹取出肾脏。左肾经横向排刀法切开后入4%多聚甲醛固定，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，对各组织块做5.0 μm厚度的切片，用于TUNEL染色。取部分右肾组织0.4 g，用冷生理盐水制成10%组织匀浆，用于检测氧化应激指标；其余右肾组织置于-80℃冰箱用于蛋白印迹检测。

1.4 TUNEL染色法检测细胞凋亡情况石蜡切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢（H2O2）室温孵育10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，各5 min，加蛋白酶K工作液37℃消化20 min，PBS漂洗3次，各5 min，加TUNEL反应液37℃孵育1 h，PBS漂洗3次，含辣根过氧化物酶（HRP）的抗荧光素抗体37℃避光孵育30 min，PBS漂洗3次，各5 min，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染后脱水，透明，封片。阴性对照TUNEL反应液中不加末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）。

1.5 凋亡指数（apoptosis index，AI）的计算细胞核呈棕黄色的细胞为TUNEL阳性细胞。每组随机取5张TUNEL阳性切片，每张切片分别随机取3个非重叠高倍视野，在CIAS-1000细胞图像分析仪上记数总细胞数和TUNEL阳性细胞数，即AI=TUNEL阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.6 氧化应激指标SOD、MDA的检测分别采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD，硫代巴比妥酸法测定MDA含量。按试剂盒说明检测各管吸光度（A）值，并计算SOD、MDA含量。

1.7 蛋白印迹法检测Bcl-2、Bax的表达情况取冷冻待用的右肾组织，用小剪刀将组织块尽量剪碎（冰上操作），加入4倍体积的蛋白裂解液，超声粉碎，4℃过夜，冷冻离心机（12 000 r/min）4℃离心30 min，去除细胞碎片。取上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。样品取50 μg与6×十二烷基硫酸钠上样缓冲液混合，100℃煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗（1∶500）4℃孵育过夜，HRP标记的二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，HRP-ECL蛋白检测发光鉴定，凝胶电泳图像分析仪进行采图［6］。

1.8 统计学方法应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TUNEL染色结果与足锌组相比，缺锌组小鼠肾小体体积明显减小，凋亡细胞明显增加；肾小管包括近端小管、远端小管上皮细胞内均可见TUNEL阳性细胞明显增多，见图1。

Fig.1The TUNEL-positive renal cells for two groups of mice（TUNEL staining，×400）图1 2组小鼠肾脏TUNEL阳性细胞表达（TUNEL染色，×400）

2.2 AI比较足锌组、缺锌组小鼠肾脏细胞AI分别为（1.41±0.21）%、（9.52±0.13）%，缺锌组明显高于足锌组（t=127.02，P＜0.01）。

2.3 氧化应激指标比较与足锌组相比，缺锌组小鼠肾细胞SOD活性下降，MDA含量增加，氧化应激反应增强（均P＜0.05），见表1。

Tab.1Comparison of the index of oxidative stress in kidney between two groups of mice表1 2组小鼠肾组织氧化应激指标比较（n=15，）

Tab.1Comparison of the index of oxidative stress in kidney between two groups of mice表1 2组小鼠肾组织氧化应激指标比较（n=15，）

*P＜0.05

M D A（μ m o l / g蛋白）0 . 4 1 ± 0 . 3 4 0 . 5 3 ± 0 . 1 5 2 . 1 9 *组别足锌组缺锌组t S O D（U / m g蛋白）6 6 . 3 7 ± 1 8 . 1 2 5 0 . 4 2 ± 1 1 . 2 4 2 . 8 4 *

2.4 蛋白印迹检测结果与足锌组比较，缺锌组小鼠肾脏Bcl-2蛋白表达量明显下调（t=2.41，P＜

0.05），Bax蛋白表达量明显上调（t=2.52，P＜0.01），Bcl-2/Bax比值下降，见图2。

Fig.2The expression changes of Bcl-2 and Bax in kidney in two groups of mice图2 2组小鼠肾脏Bcl-2和Bax蛋白表达变化

3 讨论

锌对细胞凋亡过程有重要的生物学影响。通常情况下，锌以锌离子、锌依赖酶或其他锌蛋白形式参与并调控细胞凋亡过程。生理浓度的锌可抑制细胞凋亡，而缺锌会导致细胞凋亡。Nodera等［2］研究发现缺锌导致大鼠胸腺、睾丸、皮肤、食管、肝和肾等器官中的细胞发生凋亡。Tomat等［7-8］研究证实缺锌会导致生长期大鼠肾脏肾小球滤过率下降，肾单位数目减少，肾脏凋亡细胞数目增加等。体外实验显示缺锌培养基或锌螯合剂可诱导多种细胞的凋亡［9］。本实验观察到膳食锌缺乏会导致生长期小鼠肾细胞发生凋亡，与以往研究结果相同，但其具体机制尚不清楚。

锌具有抗氧化作用，缺锌会导致机体氧化应激反应增强。生理条件下，机体内自由基的产生和清除处于动态平衡，SOD是机体主要的自由基清除酶之一。锌对于稳定SOD的立体结构咪唑桥的活性中心起着重要的作用，锌含量下降可能导致SOD酶蛋白的立体结构被破坏，使SOD失去酶促催化循环功能，表现为SOD活性降低，自由基清除不足，导致脂质过氧化物催化裂解产生MDA，MDA对细胞有毒性作用，可与蛋白质分子内和分子间交联，诱发细胞凋亡［10］。本实验发现缺锌小鼠肾组织中SOD活性降低，MDA含量增高，提示锌离子缺乏导致肾组织内抗氧化系统被破坏，氧化应激反应增强，引发细胞凋亡。

另外，在氧化应激介导的细胞凋亡中，凋亡相关因子表达及活性会发生改变。研究表明，Bcl-2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促进凋亡蛋白，并且Bax是Bcl-2活性的主要调控因子，Bcl-2与Bax蛋白的比值决定细胞是否发生凋亡［11］。本研究发现，膳食缺锌可导致发育期小鼠肾脏中抑制凋亡因子Bcl-2的表达下调，而促进凋亡因子Bax表达上调，Bcl-2/Bax比值下降，由此推测其可能是肾细胞凋亡增加的原因之一。

综上所述，膳食缺锌可导致生长期小鼠肾细胞抗氧化酶活性降低，氧化应激反应增强及细胞凋亡相关因子Bcl-2和Bax蛋白表达改变，最终导致肾细胞发生凋亡。这一改变是否会影响肾脏功能及诱发相应的肾脏疾病，仍有待于下一步的研究证实。

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（2015-04-29收稿 2015-05-26修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Study on the mechanism of apoptosis of mouse kidney cells in dietary zinc deficiency during the growth period

TIAN Juan，GUO Fang，LI Xiaoming
Department of Histology and Embryology，Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China

ObjectiveTo observe the cell apoptosis，oxidative stress reaction and expressions of Bcl-2 and Bax in kid⁃ney of dietary zinc deficiency mice during growth period，and discuss the mechanism of renal cell apoptosis induced by zinc deficiency.MethodsThirty weaning male mice were randomly divided into zinc-deficient group and zinc-adequate group，and 15 mice for each group.Zinc-deficient group was fed with zinc deficiency diet（0.85 mg/kg），while zinc-adequate group was fed with enough zinc diet（30 mg/kg）.The TUNEL method was applied to observe the cell apoptosis，and the apoptotic in⁃dex was measured.The content of SOD and MDA were detected to observe the oxidative stress reaction in kidney.The ex⁃pression levels of Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot assay.ResultsCompared with zinc-adequate group，the cell apoptosis and oxidative stress reaction were increased in zinc-deficient group.The expression of Bcl-2 de⁃creased，and the expression of Bax increased.The ratio of Bcl-2 and Bax declined in kidney of zinc deficiency mice.Conclu⁃sionDiet zinc deficiency in growth period may result in the decreased antioxidase，the increased oxidative stress reaction，and the changed Bcl-2 and Bax expression，which promote the occurrence of cell apoptosis in kidney.

zinc；apoptosis；kidney；oxidative stress；bcl-2-associated X protein；zinc deficiency

R737.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.016

辽宁省科学技术计划项目（2013022067）；辽宁省教育厅科学技术研究项目（L2012307）；辽宁省大学生创新创业训练计划项目（201410160037）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201410160037）；辽宁省高等学校优秀人才项目（LJQ2013092）

辽宁医学院组织学与胚胎学教研室（邮编121001）

田娟（1976），女，博士，硕士研究生导师，主要从事肾脏发育生物学研究