脑源性神经营养因子可减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤

2015-11-24 09:00王诗才陈太军黄美松朱少铭
天津医药 2015年11期
关键词:存活率心肌细胞预处理

王诗才,陈太军,黄美松,朱少铭

脑源性神经营养因子可减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤

王诗才,陈太军,黄美松,朱少铭△

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)预处理对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及其作用机制。方法体外培养H9c2心肌细胞并以缺氧(95%N2+5%CO2)培养4 h后复氧(95%O2+5%CO2)培养12 h建立H/ R模型,并分为Control组、H/R组、不同浓度(1、10、100 μg/L)BDNF预处理后H/R组、酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)inhibitor组(同时加入100 μg/L BDNF和1∶1 000的TrkB inhibitor预处理后H/R组)。利用MTT方法检测各组心肌细胞的细胞存活率;并测定各组心肌细胞H/R损伤后乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量及活性;流式细胞术测定各组心肌细胞的凋亡率;Western-blot检测TrkB、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果与Control组相比,H/R组细胞存活率明显下降,LDH、CK和MDA含量升高,SOD活性降低,细胞凋亡率升高,抗凋亡Bcl-2蛋白表达下降,促凋亡Bax蛋白表达升高(均P<0.05)。与H/R组相比,不同浓度BDNF预处理H9c2心肌细胞后H/R,各组细胞存活率均明显上升,CK、LDH、MDA含量逐渐下降,SOD活性升高,细胞凋亡率下降,TrkB和Bcl-2蛋白表达升高,而Bax蛋白表达降低,但BDNF的作用均受到TrkB inhibitor的抑制。结论BDNF预处理能够提高H9c2心肌细胞H/R损伤的细胞存活率,通过降低细胞凋亡率和提升细胞抗氧化能力而发挥保护作用,并与BDNF-TrkB信号通路有关。

脑源性神经营养因子;肌细胞,心脏;细胞低氧;受体,trkB;氧化性应激;细胞凋亡;缺氧/复氧损伤

临床和基础医学资料表明,心肌组织缺血再灌注(I/R)损伤严重影响缺血性心血管疾病的治疗,是术后引发死亡的主要原因之一[1]。随着再灌注治疗在临床的广泛开展,I/R损伤问题已成为当前临床研究的焦点。近来研究表明心肌I/R过程中的氧化应激和心肌细胞功能障碍及细胞凋亡参与了I/R损伤的发生[2]。脑源性神经营养因子(brain-derived neu⁃rotrophic factor,BDNF)是神经营养因子家族的主要成员之一,存在于中枢神经系统和周围神经系统,具有维持神经元存活和生长的作用[3]。最新研究表明BDNF还广泛表达于许多非神经组织如血管内皮细胞和心肌组织细胞中,并能够调节血管损伤修复和促进伤口愈合,说明神经源性因素在心血管系统损伤修复中也能发挥作用[4]。另有研究发现当心肌组织缺血预处理时心肌细胞中BDNF mRNA和蛋白表达会明显上调,提示BDNF可能会作为神经源性的心肌保护因素之一在心肌I/R中发挥作用[5],但其具体机制尚少见研究。本研究构建H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型模拟心肌I/R损伤,观察BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤的影响,并从抗细胞凋亡和氧化应激方面探讨其作用机制及是否通过BDNF-TrkB信号通路发挥作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及实验试剂H9c2心肌细胞株购自北京中科院细胞资源中心;DMEM/F-12细胞培养基、胎牛血清、0.25% EDTA胰蛋白酶购自美国Hyclone公司;BDNF、酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)抑制剂(TrkB-inhibitor)购自美国R&D公司;二苯基溴化四氮唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司;肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程公司;FITC-Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京碧云天生物公司;多克隆兔抗鼠TrkB、Bcl-2、Bax抗体购自美国Abcam公司;HRP标记山羊抗兔IgG二抗、ECL化学发光试剂购自北京博奥森生物公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 H/R模型的建立及心肌细胞分组将冻存复苏的H9c2心肌细胞在10%胎牛血清及含双抗(青霉素、链霉素)的DMEM/F12细胞培养基中培养,并置于37℃、5%CO2培养箱中。待细胞贴壁生长至80%以上时,消化收集细胞进行后续实验。选用生长状态良好的H9c2心肌细胞构建H/R损伤模型。先用以95%N2+5%CO2充分饱和的不含胎牛血清的DMEM/F12培养基培养H9c2细胞,并放入含95%N2+5%CO2的混合气体的培养箱中缺氧培养4 h,后更换含胎牛血清的正常培养基放回含95%O2+5%CO2培养箱中复氧培养12 h,以构建H9c2心肌细胞H/R损伤模型。将培养的H9c2心肌细胞分为以下几组:(1)正常对照未H/R损伤组(Control组)。(2)H/R组,即缺氧4 h后复氧培养12 h。(3)1 μg/L BDNF+H/R组,即1 μg/L BDNF预处理正常培养24 h后H/ R。(4)10 μg/L BDNF+H/R组,即10 μg/L BDNF预处理正常培养24 h后H/R。(5)100 μg/L BDNF+H/R组,即100 μg/L BDNF预处理正常培养24 h后H/R组。(6)TrkB inhibitor组,即100 μg/L BDNF和1∶1 000的TrkB inhibitor预处理正常培养24 h后H/R组。

1.2.2 MTT方法检测细胞存活率取生长状态良好的H9c2心肌细胞,消化离心后收集并用培养基稀释至5×104个/mL接种于96孔板中,同时设定空白对照孔,即不加细胞按照同步骤处理,等细胞同步化培养贴壁后,按照上述分组分别处理各组细胞。等培养结束后,在每组各细胞孔中加入20 μL

的MTT溶液(5 mg/L),在37℃下继续正常培养4 h,弃去上清后在每孔中加入150 μL的DMSO溶液,振荡反应10 min后,在酶标仪上测定各孔在590 nm处的光密度(OD)值。每组同时设置5个重复孔。各组心肌细胞的存活率(%)=(处理组OD-空白对照组OD)/(Control组OD-空白对照组OD)× 100%。

1.2.3 LDH、CK、MDA及SOD含量测定将H9c2心肌细胞接种于24孔板中经相同分组处理后,继续培养24 h。收集各组细胞的上清液,按照检测试剂盒说明,利用比色法测定各组H9c2心肌细胞经不同处理H/R后CK、LDH的漏出量变化。同时收集各组处理完毕的细胞,利用RIPA蛋白提取试剂提取各组细胞中总蛋白,并按照试剂盒说明测定细胞内MDA含量及SOD活性变化。

1.2.4 细胞凋亡率检测各组H9c2心肌细胞经相同分组处理后,用含0.25%的EDTA胰酶消化,离心收集细胞,用PBS洗涤1遍后,用PBS重悬细胞并调整细胞浓度为106个/mL,每组取出200 μL的细胞悬液,先用FITC标记的Annexin-V和PI各5 μL混匀后室温避光孵育20 min,后用PBS洗涤2遍,低速离心收集细胞,并用150 μL PBS重悬,立即用流式细胞检测仪上样检测各组心肌细胞H/R后的凋亡率变化。

1.2.5 Western-blot检测TrkB、Bcl-2及Bax表达收集各组处理并培养结束的H9c2心肌细胞,PBS洗涤1次后,利用RIPA强细胞裂解液提取各组细胞中总蛋白,并用BCA试剂盒测定细胞中总蛋白浓度。取每组中30 μg总蛋白进行12%SDS-PAGE凝胶电泳,电泳结束后半干法转PVDF膜,含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭30 min后,分别孵育多克隆兔抗鼠TrkB、Akt、p-Akt及内参β-actin一抗(均1∶1 000稀释)于4℃过夜,后TBST洗涤3次,再分别孵育HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀释)2 h,TBST洗涤3次后,PVDF膜用ECL化学发光法显影,并放入凝胶扫描系统曝光拍照。运用Quantity One软件计算分析各目的蛋白条带和内参蛋白条带的灰度比值表示蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量数据均用均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间多重比较采用Turkey检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤细胞存活率的影响MTT检测发现,经不同浓度BDNF预处理能够提高H9c2心肌细胞H/R损伤后的细胞存活率,与Control组相比,H/R组H9c2心肌细胞的存活率明显下降(P<0.05);而经1、10、100 μg/L BDNF+H/R组,细胞存活率与H/R组相比均上升(均P<0.05),并具有浓度效应;TrkB inhibitor组细胞存活率低于100 μg/L BDNF+H/R组(P<0.05),见表1。

2.2 BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤CK、LDH、MDA及SOD含量的影响与Control组相比,H/R组H9c2心肌细胞中CK、LDH漏出量和MDA含量均显著增加,而SOD活性明显下降(均P<0.05);与H/R组相比,1、10、100 μg/L BDNF+H/R组,除1 μg/L BDNF+H/R外各组的CK漏出量,各组的LDH漏出量和MDA含量均显著下降,SOD活性均显著上升(P<0.05);与100 μg/L BDNF+H/R组比较,TrkB inhibitor组CK、LDH漏出量和MDA含量增高,SOD活性降低(P<0.05),但与H/R组相比无明显变化,见表2。

Tab.1The effects of BDNF pre-treatment on the survival rate and apoptotic rate of H9c2 myocardial cells after H/R injury表1 BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤后细胞存活率和细胞凋亡率的影响(n=6,%)

Tab.1The effects of BDNF pre-treatment on the survival rate and apoptotic rate of H9c2 myocardial cells after H/R injury表1 BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤后细胞存活率和细胞凋亡率的影响(n=6,%)

**P<0.01;a与Control组比较,b与H/R组比较,c与100 μg/L BDNF+H/R组比较,P<0.05;表2、3同

组别C o n t r o l组H / R组1 μ g / L B D N F + H / R组1 0 μ g / L B D N F + H / R组1 0 0 μ g / L B D N F + H / R组T r k B i n h i b i t o r组F细胞存活率1 0 1 . 2 3 ± 1 . 3 3 5 2 . 4 6 ± 3 . 3 3 a 6 7 . 4 3 ± 2 . 8 9 b 7 5 . 5 4 ± 3 . 2 9 b 8 8 . 5 6 ± 4 . 2 3 b 5 7 . 9 2 ± 4 . 2 4 c 3 3 . 5 7 1 * *细胞凋亡率7 . 6 9 ± 1 . 4 6 4 1 . 9 4 ± 2 . 5 6 a 3 2 . 2 4 ± 2 . 5 2 b 2 2 . 3 7 ± 2 . 9 8 b 1 6 . 3 7 ± 2 . 5 4 b 4 6 . 4 3 ± 3 . 9 6 c 2 4 . 5 2 0 * *

Tab.2The effects of BDNF pre-treatment on the CK,LDH,MDA and SOD levels of H9c2 myocardial cells after H/R injury表2 BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤后CK、LDH、MDA及SOD含量的影响(n=6)

Tab.2The effects of BDNF pre-treatment on the CK,LDH,MDA and SOD levels of H9c2 myocardial cells after H/R injury表2 BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤后CK、LDH、MDA及SOD含量的影响(n=6)

组别C o n t r o l组H / R组C 0 1 1 μ g / L B D N F + H / R组1 0 μ g / L B D N F + H / R组1 0 0 μ g / L B D N F + H / R组T r k B i n h i b i t o r组F K(U / m L). 7 9 ± 0 . 1 2 . 6 9 ± 0 . 2 2 a 1 . 3 3 ± 0 . 1 4 1 . 1 4 ± 0 . 1 9 b 0 . 8 9 ± 0 . 2 1 b 1 . 8 7 ± 0 . 1 8 c 8 . 3 3 3 * * L D H(U / m L)0 . 1 8 ± 0 . 0 4 0 . 7 6 ± 0 . 0 3 a 0 . 6 1 ± 0 . 0 4 b 0 . 4 6 ± 0 . 0 5 b 0 . 3 3 ± 0 . 0 4 b 0 . 6 8 ± 0 . 0 4 c 1 9 . 5 8 8 * *组别C o n t r o l组H / R组1 μ g / L B D N F + H / R组1 0 μ g / L B D N F + H / R组1 0 0 μ g / L B D N F + H / R组T r k B i n h i b i t o r组F M D A(m m o l / g p r o)2 . 4 7 ± 0 . 7 9 8 . 1 0 ± 1 . 1 5 a 6 . 5 9 ± 0 . 6 6 b 5 . 4 7 ± 0 . 4 8 b 4 . 1 2 ± 0 . 8 8 b 7 . 4 4 ± 0 . 9 2 c 1 1 . 5 5 9 * * S O D(U / m g p r o)1 6 3 . 4 8 ± 1 0 . 2 3 4 4 . 3 1 ± 1 3 . 4 8 a 7 6 . 4 5 ± 8 . 9 4 b 1 0 2 . 5 2 ± 6 . 9 7 b 1 4 3 . 5 8 ± 7 . 5 9 b 5 5 . 6 8 ± 9 . 2 2 c 2 9 . 8 9 3 * *

2.3 BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤细胞凋亡率的影响与Control组相比,H9c2心肌细胞

H/R后细胞凋亡率显著增加(P<0.05);与H/R组相比,1、10、100 μg/L BDNF+H/R组,细胞凋亡率却逐渐降低(均P<0.05);TrkBinhibitor和100μg/L的BDNF同时作用后H/R,细胞凋亡率未见明显下降,但明显高于100μg/LBDNF+H/R组(P<0.05),见图1、表1。

Fig.1 The cell apoptosis of H9c2 myocardial cells tested by flow cytometry图1 流式细胞术检测H9c2心肌细胞凋亡

2.4 BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤细胞TrkB、Bcl-2及Bax表达的影响与Control组相比,H/R组TrkB表达未见明显变化,Bcl-2表达明显下降,Bax表达明显升高(均P<0.05);1、10、100 μg/L BDNF预处理H9c2心肌细胞后H/R,TrkB、Bcl-2表达升高,Bax表达下降(均P<0.05);与100 μg/L BDNF+H/R组比较,TrkB inhibitor组TrkB、Bcl-2表达降低,Bax表达升高(P<0.05),见图2、表3。

Fig.2The expression of TrkB,Bcl-2 and Bax tested by Western blot assay图2 Western-blot检测TrkB、Bcl-2和Bax表达

Tab.3The effects of BDNF pre-treatment on expressions of TrkB,Bcl-2 and Bax protein in H9c2 myocardial cells after H/R injury表3 BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤后TrkB、Bcl-2和Bax表达的影响(n=6,)

Tab.3The effects of BDNF pre-treatment on expressions of TrkB,Bcl-2 and Bax protein in H9c2 myocardial cells after H/R injury表3 BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤后TrkB、Bcl-2和Bax表达的影响(n=6,)

组别C o n t r o l组H / R组1 μ g / L B D N F + H / R组1 0 μ g / L B D N F + H / R组1 0 0 μ g / L B D N F + H / R组T r k B i n h i b i t o r组F T r k B / β -a c t i n 0 . 2 8 ± 0 . 0 4 0 . 2 5 ± 0 . 0 3 0 . 4 7 ± 0 . 0 5 b 0 . 7 5 ± 0 . 0 5 b 0 . 8 8 ± 0 . 0 4 b 0 . 3 3 ± 0 . 0 6 c 5 . 2 3 5 * * B c l -2 / β -a c t i n 0 . 6 8 ± 0 . 0 4 0 . 2 6 ± 0 . 0 3 a 0 . 3 5 ± 0 . 0 3 b 0 . 4 7 ± 0 . 0 4 b 0 . 6 4 ± 0 . 0 5 b 0 . 3 8 ± 0 . 0 4 c 9 . 2 5 3 * * B a x / β -a c t i n 0 . 1 7 ± 0 . 0 3 0 . 5 2 ± 0 . 0 4 a 0 . 3 8 ± 0 . 0 3 b 0 . 2 5 ± 0 . 0 4 b 0 . 1 5 ± 0 . 0 5 b 0 . 5 4 ± 0 . 0 4 c 1 1 . 5 5 5 * *

3 讨论

缺血性心脏病是心血管系统中发病率及死亡率较高的疾病,临床上多开展血管成形术、冠状动脉介入术等进行治疗,但恢复冠状动脉血流灌注后,常引发心肌组织I/R损伤[6]。因此,如何有效保护缺血心肌细胞,减轻心肌细胞I/R损伤是目前研究的重点。近年研究表明BDNF能够在心肌损伤后改善心肌微循环方面起到重要作用[7],但其具体机制及能否在心肌组织I/R损伤修复保护中发挥作用尚未知。有研究显示I/R触发细胞内产生大量活性氧自由基,诱导心肌细胞凋亡,是I/R损伤的主要原因之一[8]。本研究利用H9c2心肌细胞构建H/R损伤模型模拟心肌缺血再灌注,研究发现BDNF预处理H9c2心肌细胞后H/R能够提高其细胞存活率并具有浓度效应,说明BDNF预处理能够减轻心肌细胞H/R损伤。

目前认为,心肌组织I/R损伤与其抗氧化应激系统受损有关,I/R过程诱导氧自由基的产生使细胞中过氧化物增多,可使细胞结构和功能受损,甚至发生凋亡[9]。CK作为心肌细胞胞内酶,其漏出量反映心肌细胞受损程度[10],而LDH也可作为心肌细胞受损伤的指标,反映细胞功能变化和细胞膜的受损程度[11]。本研究中H9c2心肌细胞H/R损伤后,CK和LDH漏出量均明显增加,说明H/R能够损伤心肌细胞,影响细胞功能和膜结构完整性。当BDNF预处理后H/R,细胞内CK、LDH漏出量均降低,说明BDNF能够对H9c2心肌细胞发挥保护作用,并维持H/R损伤后心肌细胞的膜结构完整性和功能。MDA作为机体脂质过氧化反应终产物,能够反映心肌细胞受氧自由基损伤的程度,而SOD作为抗氧化酶,其活性高低反映机体抗氧化能力[12]。本研究中H9c2心肌细胞H/R损伤后,细胞中MDA含量上升而SOD活性下降,表明心肌细胞H/R损伤后其抗氧化系统严重受损导致抗氧化能力下降。而不同浓度

BDNF预处理H9c2心肌细胞后再H/R,细胞内MDA含量能够逐渐下降,SOD活性逐渐上升,说明BDNF能够通过提升心肌细胞抗氧化和清除氧自由基的能力以减轻H/R损伤。

在对离体灌流大鼠心脏组织研究中发现,再灌注早期会发生心肌细胞的凋亡,而Bcl-2和Bax参与心肌细胞凋亡[13]。本研究显示BDNF预处理H9c2心肌细胞后H/R,细胞凋亡率明显降低,即BDNF预处理能够通过降低细胞凋亡率,减轻H9c2心肌细胞H/R损伤,同时BDNF预处理后H/R,H9c2心肌细胞中Bcl-2表达升高,Bax表达下降,说明BDNF预处理可通过调控Bcl-2和Bax表达发挥降低H/R损伤后凋亡的作用。TrkB是BDNF的功能性受体,BDNF和TrkB结合后,受体通过二聚体化及胞内激酶特异性酪氨酸磷酸化而激活,介导下游信号传导,发挥各种生理作用[14]。BDNF-TrkB通路不仅在神经系统发育和功能中发挥重要作用,而且能够介导心脏微血管内皮细胞增殖和存活,在心肌血管新生过程中扮演重要角色[15]。本研究发现,随着BDNF预处理浓度的升高,H/R后H9c2心肌细胞中TrkB的表达量也随之升高;当高浓度BDNF作用同时加入TrkB inhibitor,与BDNF单独作用组相比,其H/R损伤后细胞存活率降低,CK、LDH漏出量和MDA含量均升高,而SOD活性降低,且细胞凋亡率升高,说明BDNF预处理对H9c2心肌细胞H/R损伤发挥的作用可能通过与TrkB受体结合激活BDNF-TrkB信号通路发挥作用。

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(2015-05-18收稿 2015-07-16修回)

(本文编辑 李国琪)

BDNF reduces the hypoxia/reoxygenation injury of H9c2 myocardial cells

WANG Shicai,CHEN Taijun,HUANG Meisong,ZHU Shaoming△
Department of Internal Medicine,Shiyan Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine,Shiyan,Hubei 442000,China△

ObjectiveTo investigate the effects of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)pretreatment on H9c2 myocardial hypoxia/reoxygenation(H/R)injury,and explore its mechanism.MethodsThe H9c2 myocardial cells were cul⁃tured in vitro and(95%O2+5%CO2)oxygen cultured 12 h after(95%N2+5%CO2)hypoxia cultured 4 h to establish the H/R model.The cells were divided into normal control group,H/R group,different concentrations(1,10,100 μg/L)BDNF pre⁃

brain-derived neurotrophic factor;myocytes,cardiac;cell hypoxia;receptor,trkB;oxidative stress;apop⁃tosis;hypoxia/reoxygenation injury

R363

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.011

湖北省十堰市中西医结合医院内科(邮编442000)

王诗才(1971),男,副主任医师,主要从事心血管疾病病理基础与临床研究

△通讯作者E-mail:zhusaoming@163.com

treatment in H/R groups and TrkB-inhibitor group(with 100 μg/L BDNF and 1∶1 000 TrkB inhibitor pre-treatment in H/R group).The cell survival rate was measured by MTT method in different groups.The lactate dehydrogenase(LDH),creatine kinase(CK),malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)content and activity were detected after H/R injury. The apoptotic rate of H9c2 myocardial cells were detected by flow cytometry,and the expressions of TrkB,Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot assay.ResultsCompared with the normal control group,the survival rate of H9c2 myocardial cells was decreased significantly in H/R model group(P<0.05),LDH,CK and MDA contents were increased and SOD activity was decreased(P<0.05).The cell apoptosis rate was increased significantly(P<0.05).The anti-apoptosis Bcl-2 protein expression was decreased,pro-apoptosis Bax protein expression was increased in H/R model group(P<0.05). Compared with the H/R model group,the cell survival rates of H9c2 myocardial cells were increased after pre-treatment with different concentrations of BDNF(P<0.05);LDH,CK and MDA contents were decreased and SOD activity were in⁃creased respectively(P<0.05).The cell apoptotic rates were decreased(P<0.05).The expressions of TrkB receptor and Bcl-2 protein gradually increased,while the expression of Bax protein was gradually decreased(P<0.05).The role of BDNF was inhibited by TrkB inhibitor.ConclusionBDNF pre-treatment can promote the cell survival rate of H9c2 myocardial cells after H/R injury,which plays a protective role by inhibiting the cell apoptotic rate and maintaining antioxidant capacity,and associates with BDNF-TrkB signaling pathways.

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