Akt/GSK-3β/eNOS通路在藏红花酸保护离体大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用

王亚光，王鹏，陶贵周△，黄建华

Akt/GSK-3β/eNOS通路在藏红花酸保护离体大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用

王亚光1，王鹏2，陶贵周1△，黄建华2

目的研究藏红花酸（CRO）对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用，探讨其与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）/糖原合成酶激酶（GSK）-3β/一氧化氮合酶（eNOS）信号通路的关系。方法SD大鼠40只，随机数字表法均分为正常（N）组、缺血再灌注（IR）组及5、10、15 mg/L加药（CRO1、CRO2、CRO3）组，比较再灌注30 min时各组心率（HR），冠脉流量（CF），左心室内压测定（LVDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax）。灌流结束TTC心肌染色评估梗死范围，分光光度法测定肌浆乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK-MB）；Western blot检测各组心肌组织内Akt、磷酸化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（p-Akt）、GSK-3β、磷酸化的糖原合成酶激酶（p-GSK）-3β、eNOS、磷酸化的一氧化氮合酶（p-NOS）。结果IR组再灌注30 min时HR、CF、LVDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax较N组及加药组降低，心肌梗死面积较加药组增大，LDH、CK-MB表达较N组及加药组增加（均P＜0.05），CRO3组再灌注指标较CRO1组升高，梗死面积降低，LDH、CK-MB表达减少（P＜0.05）。IR组Akt、GSK-3b及eNOS较N组及加药组的表达差异无统计学意义，但p-Akt、p-GSK-3β及p-NOS与N组及加药组降低，且CRO3组较CRO1组增加（均P＜0.05）。结论藏红花酸能够减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，其作用机制可能与激活Akt/GSK-3β/eNOS通路并影响其磷酸化水平有关。

体外循环；再灌注损伤；蛋白激酶类；糖原合成酶激酶-3β；一氧化氮合酶；氧化磷酸化

目前，心肌缺血再灌注损伤（MIRI）成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法获得最佳疗效的主要难题［1］。藏红花是多年生草本植物，可以调节纤维蛋白溶酶原激活剂及其抑制物之间的平衡，改善冠心病、心绞痛患者纤维蛋白的溶解功能，减少血栓形成［2］。王艳艳等［3］动物实验证实，藏红花酸（crocetin，CRO）预处理能够上调凋亡抑制蛋白（Bcl）-2、下调促凋亡蛋白（Bax），从而对损伤的心肌细胞产生保护作用。但有关CRO在体外对心肌缺血再灌注的相关研究少见。本实验旨在观察CRO对大鼠丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）、糖原合成酶激酶（GSK）-3β、一氧化氮合酶（eNOS）及其磷酸化形式表达的影响，探讨其对再灌注心肌的保护作用，以期为CRO改善MIRI的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料健康清洁级SD大鼠40只，体质量250～300 g，12～14周龄，雌雄不限，购于辽宁医学院实验动物中心。灌流装置购于美国RADNOTI公司，MP150多导生理记录分析系统购于美国BIAPOC公司，Krebs-Henseleit（K-H）试剂购于sigma公司，左室压力测定使用泰盟BL-420S生物功能实验系统，TTC试剂购于北京科博赛而科技有限公司，乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK-MB）试剂盒购于南京建成生物有限公司，CRO购自济南浩化实业有限责任公司（批号为20121123）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与模型建立40只大鼠随机数字表法分为空白对照（N）组、缺血再灌注（IR）组、5 mg/L加药（CRO1）组、10 mg/L加药（CRO2）组、15 mg/L加药（CRO3）组，每组均为8只。大鼠干预前均自由进食，自由饮水。所有大鼠20%乌拉坦（5 μL/g）麻醉，1 000 U肝素静脉注射，迅速开胸，取出心脏，迅速移至Langendorff灌流装置，主动脉逆行插管，用KH液80 cm H2O恒压（1 cm H2O=0.098 kPa），Krebs-Henseleit（K-H）液成分NaCl 118 mmol/L，KCl 4.74 mmol/L，KH2PO41.19 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.19 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L。调pH值为7.4。以体积分数为950 mL/L O2+50 mL/L CO2，水浴维持缺血温度37℃。心脏挂至灌流装置后，插入球囊，另一端连接换能器［4］。非循环模式下预灌流20 min后，IR组停灌30 min取K-H液再灌流45 min；CRO1组、CRO2组和CRO3组于再灌注时，灌流液中分别加入CRO 5、10及15 mg/L，余同IR组；对照组连续灌流95 min。凡由大鼠自身心脏结构决定心率（HR）＜200次/min或冠脉流量＜8 mL/min，予以排除［4］。再灌注30 min时测冠脉流量（CF）＞5 mL/min、HR＞170次/min为造模成功。

1.2.2 灌流期间观察指标在灌流稳定后缺血再灌流30 min时测各组流出K-H液冠脉流量（mL/min）、MP150测HR、BL-420S生物功能实验系统测左心室内压（LVDP）、等容收缩期左心室内压最大变化率（LV+dp/dtmax）及等容舒张期左心室内压最大变化速率（LV-dp/dtmax）。

1.2.3 TTC染色及酶谱测定在95 min灌注结束时取各组心脏于-20℃冻存1 h，N组不参与染色，由心尖至心底部横向均匀切片，1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）37℃染色5 min，后于10%福尔马林固定10 min，数码照相机拍照，苍白色为梗死区。采用图像分析仪Image pro plus 7.0软件处理得面积百分比。另取心尖组织0.5 g，制成10%心肌均浆，分光光度法分别在450 nm和340 nm处测定LDH、CK-MB含量。

1.2.4 Western blot取各组左室前壁心肌组织，提取蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。封闭液封闭，抗-Akt单克隆抗体（1∶1 500）、抗p-Akt单克隆抗体（1∶1 000）、抗-GSK-3β单克隆抗体（1∶1 000）、抗p-GSK-3β单克隆抗体（1∶1 000）、抗eNOS单克隆抗体（1∶1 000）及抗p-eNOS单克隆抗体（1∶1 000），以上抗体均为Cell Signaling公司产品，辣根过氧化酶标记的鼠抗兔为二抗，TBST洗膜后成像，Akt、GSK-3β、eNOS的水平以Akt/β-actin、p-Akt/β-actin、GSK-3β/β-ac⁃tin、p-GSK-3β/β-actin、eNOS/β-actin、p-eNOS/β-actin表示，用图像分析仪Image pro plus 7.0软件凝胶图像分析系统分析灰度值。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0软件统计分析。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRO对各组中HR、CF、LVDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax的影响N组、CRO1、CRO2及CRO3组CF、HR、LVDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax均高于IR组（P＜0.05）。CRO3组各项指标较CRO1、CRO2组升高（P＜0.05），CRO2组、CRO1组差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Tab.1Comparison of CF，HR and LVDP during the period of ischemia/reperfusion between five groups表1 各组灌流期间CF、HR及LVDP等比较（n=8，）

Tab.1Comparison of CF，HR and LVDP during the period of ischemia/reperfusion between five groups表1 各组灌流期间CF、HR及LVDP等比较（n=8，）

**P＜0.01；a与IR组比较，b与CRO1组比较，c与CRO2组比较，均P＜0.05；1 mmHg=0.133 kPa

组别N组I R组C R O1组C R O2组C R O3组F C F（m L / m i n）9 . 9 ± 0 . 6 a 5 . 2 ± 0 . 5 6 . 3 ± 0 . 2 a 6 . 7 ± 0 . 5 a 7 . 3 ± 0 . 2 a b c 2 5 . 7 6 8 * * H R（次/ m i n）2 6 2 ± 4 a 1 8 1 ± 6 1 9 6 ± 7 a 2 1 0 ± 6 a 2 2 1 ± 6 a b c 2 1 . 4 3 2 * * L V D P（m m H g）7 1 . 8 ± 9 . 9 a 3 3 . 8 ± 1 . 5 4 4 . 2 ± 3 . 0 a 4 5 . 6 ± 2 . 5 a 5 2 . 1 ± 5 . 6 a b c 1 8 . 5 6 4 * * L V + d P / d t m a x（m m H g / s）1 4 8 2 ± 7 6 a 7 1 6 ± 5 9 7 9 2 ± 3 6 a 8 1 2 ± 4 8 a 8 9 8 ± 7 8 a b c 3 3 . 7 4 6 * * L V -d P / d t m a x（m m H g / s）1 1 3 7 ± 4 8 a 5 8 2 ± 5 2 6 9 0 ± 8 3 a 7 2 3 ± 6 8 a 7 7 5 ± 7 9 a b c 1 7 . 8 5 2 * *

2.2 TTC染色梗死面积比较IR组、CRO1组、CRO2组及CRO3组的梗死面积分别为（48.7±9.8）%、（32.7± 4.2）%、（29.1±2.7）%、（21.7±4.5）%（F=34.264，P＜0.01），其中IR组较CRO1组、CRO2组及CRO3组增

大，CRO3组较CRO1组减小（均P＜0.05），见图1。

Fig.1TTC staining showing infarction area in different groups图1 各组梗死心肌TTC染色比较

2.3 各组LDH、CK-MB表达水平比较IR组较N组、CRO1、CRO2及CRO3组的LDH、CK-MB含量升高（P＜0.01）；CRO3组LDH、CK-MB含量较CRO1组降低（P＜0.05），CRO3组LDH含量较CRO2组降低（P＜0.05），见表2。

Tab.2The expressions of LDH and CK-MB in myocardial homogenate表2 心肌均浆LDH、CK-MB的检测结果（n=8，）

Tab.2The expressions of LDH and CK-MB in myocardial homogenate表2 心肌均浆LDH、CK-MB的检测结果（n=8，）

**P＜0.01；a与IR组比较，b与CRO1组比较，c与CRO2组比较，均P＜0.05

C K -M B（U · L -1）2 1 9 ± 1 2 a 6 2 1 ± 3 6 5 2 1 ± 4 5 a 3 5 8 ± 5 3 a b 3 3 3 ± 1 9 a b 2 2 . 5 0 8 * *组别N组I R组C R O 1组C R O 2组C R O 3组F L D H（U · g -1）1 4 9 6 . 2 ± 2 0 1 . 5 a 2 2 5 9 . 6 ± 1 7 8 . 3 2 0 3 0 . 8 ± 4 5 6 . 6 a 1 7 5 7 . 8 ± 4 7 6 . 2 a b 1 6 1 3 . 9 ± 3 5 6 . 4 a b c 1 7 . 3 5 2 * *

2.4 Western blot检测结果IR组与N组、CRO1、CRO2及CRO3组的Akt、GSK-3β、eNOS活性差异无统计学意义（P＞0.05）；IR组较N组、CRO1、CRO2及CRO3组的p-Akt、p-GSK-3β、p-eNOS表达降低（P＜0.05），CRO3组p-Akt、p-GSK-3β、p-eNOS表达较CRO1组增加（P＜0.05），见图2～4、表3。

Fig.2Comparison of Akt and p-Akt activity between five groups图2 Akt与p-Akt在不同组内活性的比较

Fig.3Comparison of GSK-3β and p-GSK-3β activity between five groups图3 GSK-3β与p-GSK-3β在不同组内活性的比较

Fig.4Comparison of eNOS and p-eNOS activity between five groups图4 eNOS与p-eNOS在不同组内活性的比较

Tab.3Comparison of protein expression between five groups表3 各组蛋白表达结果的比较（n=8，）

Tab.3Comparison of protein expression between five groups表3 各组蛋白表达结果的比较（n=8，）

**P＜0.01；a与IR组比较，b与CRO1组比较，P＜0.05

组别N组I R组C R O 1组C R O 2组C R O 3组F A k t 2 . 3 0 ± 0 . 1 2 2 . 2 9 ± 0 . 2 1 2 . 3 1 ± 0 . 1 7 2 . 3 4 ± 0 . 2 0 2 . 2 7 ± 0 . 1 8 0 . 9 2 1 p -A k t 1 . 0 3 ± 0 . 2 6 a 0 . 6 7 ± 0 . 1 2 1 . 0 4 ± 0 . 1 8 a 1 . 1 1 ± 0 . 1 6 a 1 . 1 9 ± 0 . 1 3 a b 1 5 . 3 7 2 * * G S K -3 β 1 . 9 5 ± 0 . 2 1 1 . 9 4 ± 0 . 2 3 1 . 9 5 ± 0 . 2 2 1 . 9 7 ± 0 . 2 1 1 . 9 6 ± 0 . 2 6 0 . 7 6 9组别N组I R组C R O 1组C R O 2组C R O 3组F p -G S K -3 β 0 . 9 2 ± 0 . 1 9 a 0 . 4 8 ± 0 . 1 6 0 . 9 6 ± 0 . 1 8 a 1 . 0 6 ± 0 . 2 3 a 1 . 2 1 ± 0 . 2 1 a b 1 3 . 2 6 7**e N O S 3 . 5 9 ± 0 . 2 3 3 . 5 7 ± 0 . 3 3 3 . 6 0 ± 0 . 2 8 3 . 6 1 ± 0 . 3 1 3 . 5 4 ± 0 . 2 8 0 . 8 2 1 p -e N O S 1 . 8 9 ± 0 . 2 6 a 0 . 8 7 ± 0 . 1 8 1 . 9 2 ± 0 . 1 7 a 2 . 1 3 ± 0 . 2 1 a 2 . 5 6 ± 0 . 2 8 a b 1 7 . 3 2 1**

3 讨论

藏红花是一种传统的中药材，CRO是其主要的活性成分之一。孙经武等［5］证实，CRO预处理在心肌缺血再灌注损伤中可以通过负性调节肿瘤坏死因子（TNF）-α，正性调节白细胞介素（IL）-10来减轻炎症反应并抑制心肌细胞的凋亡，发挥心肌保护作用。李玲等［6］研究证实，通过CRO对大鼠的预处理能够减轻缺血再灌注对心肌细胞的损伤，其作用机制与缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子的表达有关。

本研究采用体外循环灌流装置，去除体液、神经及心脏前后负荷对再灌注的影响。结果显示，IR组与N组、各加药组比较，再灌流期间CF、HR、LVDP、LV+dp/dtmax、LV-dp/dtmax降低，TTC染色梗死面积较各加药组增大，心肌匀浆LDH、CK-MB的表达较N组、各加药组增加，表明缺血再灌注可导致心肌受损，也表明造模成功，提示CRO可以减轻离体大鼠心肌梗死模型的MIRI。再灌注期间CRO3组各项指标较CRO1、CRO2组升高，而CRO2组、CRO1组差异无统计学意义，CRO3组较CRO1组梗死面积及LDH、CK-MB的表达降低，表明高剂量的CRO发挥作用更明显，而抑制心肌细胞凋亡可能有助于CRO对心脏缺血再灌注保护作用。

细胞凋亡是组织损伤继发于缺血再灌注损伤的重要机制，心肌组织在缺血后再灌注的开始时，多种心肌保护手段均能够主动募集信号转导通路，其中Akt/GSK-3β/eNOS信号转导通路是最重要的途径之一，具有显著的抗心肌细胞凋亡、保护再灌注心肌的

作用［7］。叶强等［8］通过观察辛伐他汀对心肌梗死后心肌细胞凋亡的影响显示，辛伐他汀可改善心肌梗死后心功能，认为其可能是通过激活Akt/GSK-3β通路，抑制心肌细胞凋亡实现。刘馨骏等［9］研究表明，红景天苷可增加缺血再灌注心肌中Akt/GSK-3β的蛋白表达及磷酸化，增强对缺血再灌注损伤心肌保护作用。AKT激活后形成p-Akt，可进一步作用于相关底物发挥抗凋亡作用［10］。众多具有心肌保护作用的激酶如PKA、PKB/Akt、PKC都汇合于GSK-3β通路，导致GSK-3β磷酸化失活，最终通过抑制线粒体死亡来减轻细胞凋亡［11］。eNOS可产生NO，通过舒张血管、减轻炎症细胞及减少血小板聚集、浸润，改善冠脉血供，对心肌内皮细胞起保护作用［12］。eNOS的翻译后修饰有着复杂的模式，而磷酸化和去磷酸化网络是调节eNOS活性的主要的翻译后修饰［13］。

本研究结果显示IR组与N组及各加药组比，Akt、GSK-3β、eNOS蛋白总量未有明显变化，但其p-Akt、p-GSK-3β、p-eNOS较N组及各加药组表达量减少，CRO3组p-Akt、p-GSK-3β、p-eNOS表达较CRO1组增加，表明CRO保护心肌缺血再灌注损伤的作用机制可能与激活Akt/GSK-3β/eNOS通路有关，但不影响Akt、GSK-3β、eNOS总量的表达，而通过影响其磷酸化水平来发挥作用，与叶强等［8］研究相一致，且高剂量的CRO发挥作用更明显。因此，抑制细胞凋亡可能是CRO保护心肌、对抗缺血再灌注损伤的机制之一，证实Akt/GSK-3β/eNOS信号转导通路在MIRI保护作用中发挥重要作用，其活性调控呈现出一个复杂而精密的调控网络。目前，由于不同氨基酸残基的磷酸化对其活性调控的机制亦各异，中药及其有效活性成分在这些方面的深入研究尚较少。

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（2015-03-13收稿 2015-06-25修回）

（本文编辑 陆荣展）

The effect of crocetin on Akt/GSK-3β/eNOS signaling pathway in myocardial ischemiareperfusion injury of isolated rat hearts

WANG Yaguang1，WANG Peng2，TAO Guizhou1△，HUANG Jianhua2
1 Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2 Key Laboratory of Tissue Engineering，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou△

ObjectiveTo study the protective effects of crocetin on myocardial ischemia-reperfusion injury，and their correlation with the signaling pathway of serine/threonine protein kinase（Akt）/glycogen synthase kinase（GSK）-3β/nitric ox⁃ide synthase（eNOS）.MethodsForty healthy SD rats were divided into normal group（N），ischemia reperfusion group（IR）and 5，10 and 15 mg/L of crocetin groups（CRO1，CRO2and CRO3）by random number table method.The values of heart rate（HR），coronary flow（CF）and left ventricular pressure measurement（LVDP，LV+dp/dtmax，LV-dp/dtmax）30 minutes after reperfusion were compared between five groups.TTC staining was used to detect the infarct volume.Spectrophotometric method was used to determinate the expression of lactate dehydrogenase（LDH）and creatine kinase（CK-MB）.The levels of Akt，the phosphorylation of Akt（p-Akt），GSK-3β，phosphorylation of GSK-3β（p-GSK-3β），eNOS and phosphorylation of eNOS（p-NOS）were detected by Western blot assay.ResultsThe HR，CF，LVDP，LV+dp/dtmax and LV-dp/dtmax were significantly lower 30 min after reperfusion in IR group than those of N group and crocetin groups（P＜0.05）.The myocardial infarction area was bigger in IR group than that of crocetin groups.The expression levels of LDH and CK-MB were signifi⁃cantly higher in IR group than those of N group and crocetin groups（P＜0.05）.The reperfusion index was higher in CRO3group than that of CRO1group.The infarction area，LDH and CK-MB expressions were significantly decreased in CRO3group than those of CRO1group（P＜0.05）.There were no significant differences in expressions of Akt，GSK-3β and eNOS between IR group，N group and crocetin groups.But p-Akt，p-GSK-3β and p-NOS were significantly decreased in IR group than those of N group and crocetin groups.The p-Akt，p-GSK-3β and p-NOS were significantly increased in CRO3group than those of CRO1group（P＜0.05）。ConclusionCrocetin has protective effects on myocrdial ischemia reperfusion injury in rats，which may be involved in the enhancing the phosphorylation of signalling pathway of Akt/GSK-3β/eNOS.

extracorporeal circulation；reperfusion injury；protein kinases；glycogen synthase kinase 3β；nitric oxide synthase；oxidative phosphorylation

R965.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.021

1锦州，辽宁医学院附属第一医院心内科（邮编121001），2院组织工程重点实验室

王亚光（1990），男，硕士研究生，主要从事冠心病的诊断与治疗研究

△通讯作者E-mail:tgz56789@163.com