黄芩素体外诱导人SCC15口腔癌细胞增殖及对凋亡的影响

翟 越 (燕山大学校医院，河北 秦皇岛 066004)

目前，临床上黄芩素(BAI)主要应用于抗炎和抗菌。研究表明，BAI能诱导细胞发生凋亡〔1～3〕，可抑制癌细胞特别是SCC15口腔癌细胞的生长〔4〕，有望成为一种治疗口腔癌症的有效药物。目前，BAI已经被应用于多种癌细胞，如乳腺癌、宫颈癌、口腔癌、食管癌、胃癌、肝癌等，可以从多种途径抑制肿瘤细胞的增殖，且均显示出了较好地诱导肿瘤细胞凋亡的作用〔5，6〕，本文观察其作用机制和效果。

1 材料与方法

1.1材料及仪器 SCC15口腔鳞状癌细胞株(中科院上海细胞库)，胎牛血清及DMEM培养基(Gibco公司)，BAI单体(纯度≥98%，南京泽朗医药科技有限公司)，噻唑蓝(MTT，南京建成生物工程研究所)，Galaxy CO2培养箱MiniGalaxy A型(英国RS Biotech公司)，MK3酶标仪(中国上海雷勃公司)。

1.2实验分组 DMEM培养基中添加10%胎牛血清培养SCC15细胞，按5×104/孔的密度将SCC15细胞接种于96孔细胞培养板，空白对照组培养正常细胞，实验组分别给予终浓度为 50、100、200 μg/ml的 BAI进行处理。

1.3MTT方法检测细胞增殖作用 将培养皿内生长至对数期状态良好的细胞弃去培养液，加0.25%胰酶消化数分钟，收集细胞于2 ml离心管中，以800 r/min离心5 min，弃上清，加入新鲜培养液，以台盼蓝排斥法进行细胞计数，根据计数的细胞数目，将SCC15细胞以5×104/孔接种于96孔培养板中，培养12 h，加入不同浓度的 BAI(终浓度为50、100、200 μg/ml)，每个浓度设4个平行复孔，阴性对照组为等体积DMEM完全培养液，并设空白调零孔(只加完全培养液，不加细胞)，于37℃、5%CO2培养箱中继续培养 12、24、36、48、72 h，弃去上清，用DMEM洗3次，洗去药物，每孔加入 MTT 20 μl，继续培养4 h后，加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶解，10 min后于酶标仪492 nm处测OD值，计算药物的体外生长抑制率，用细胞生长抑制率对药物作用时间绘制回归曲线，求出半数抑制浓度(IC50)。细胞生长抑制率(%)=(对照组平均OD值－用药组平均OD值)/对照组平均OD值×100%。

1.4荧光染色计算凋亡指数 取终浓度为50、100、200 μg/ml BAI处理对数生长期的SCC15细胞，镜下计数，调整浓度为5×105/ml，悬浮于1 ml培养基中，加入10 μl Hoechst33342染液，混匀，37℃孵育5～15 min;4℃，800 r/min离心5 min，弃上清，加入1.0 ml缓冲液A悬浮细胞和磺化丙啶(PI)染液5 μl，避光混匀，荧光显微镜下观察。Hoechst33342用氪激光激发的紫外光，于352 nm波长处产生蓝色荧光，PI用氩离子激光激发荧光，于激发光波波长488 nm产生红色荧光。蓝绿色为凋亡细胞，红色为坏死细胞。计数200个细胞，凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5SCC15细胞DNA片段化的凝胶电泳检测 SCC15细胞培养于培养瓶内，贴壁后加入 BAI(终浓度为 50、100、200 μg/ml)，培养48 h后，严格按照碧云天小剂量提取试剂盒操作，提取DNA。将提取DNA加入上样缓冲液，经1%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶(EB)染色观察。

1.6统计学方法 应用SAS9.13软件，试验数据以s表示，组间差异的显著性先进行完全随机设计的方差分析，不同组间的均数差异性用邓肯的多范围检测。

2结果

2.1BAI对SCC15口腔癌细胞株生长的抑制作用 BAI在体外对SCC15细胞株具有直接的抑制增殖作用，并且呈时间和剂量依赖性，对照组药物处理SCC15细胞24 h的抑制率OD值为0.82 ±0.01，50、100、200 μg/ml的 OD 值分别为 0.69 ± 0.02，0.45±0.03，0.41±0.01，与对照组比较差异显著(P ＜0.05，P＜0.01)。利用回归曲线 BAI对 SCC15细胞的 IC50是177.36 μg/ml。见图 1。

图1 BAI对SCC15细胞生长抑制作用

2.2荧光染色观察BAI诱导细胞凋亡指数的变化 BAI作用12 h后，细胞开始出现凋亡的形态学改变，24 h和48 h凋亡细胞增多，72 h凋亡细胞明显增加，BAI诱导SCC15细胞凋亡具有时间、剂量依赖性。随着BAI作用浓度和时间的增加，细胞凋亡数增加。镜下可见细胞变小，核皱缩，荧光强度增强，呈囊月或环状，核仁消失，新月体样改变，凋亡小体形成等。而被PI染成红色的坏死细胞相对较少，其多少与药物浓度和作用时间无明显关系。见表1。

2.3BAI诱导SCC15细胞DNA片段化的观察 BAI(终浓度50、100、200 μg/ml)处理 SCC15 细胞后，琼脂糖电泳出现明显的“梯状”条带，而对照组未出现梯状条带，高浓度的BAI的DNA梯状条带最明显，存在剂量依赖性。见图2。

表1 BAI在不同的作用时间诱导SCC15细胞凋亡指数的变化(%)

图2 BAI诱导SCC15细胞48 h后的凝胶电泳图

3讨论

BAI是从唇形科植物黄芩中提取出来的具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化、清除氧自由基、抗癌、抗凝、抗血栓形成和保护肝脏、心脑血管、神经元等多种药理活性等的黄酮类化合物。有关BAI的一些制剂已在临床应用于上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽炎、慢等多种疾病的治疗，并显示出较好的疗效。BAI作为天然的化合物，具有多种药理作用，并且抗癌谱广，临床利用价值高。因此，本实验利用MTT比色法和流式细胞仪检测BAI对SCC15细胞增殖和凋亡的影响，为口腔癌的治疗奠定基础。

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3 童旭辉，董淑英，陶 亮.黄芩素对人子宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用〔J〕.蚌埠医学院学报，2009;34(6):468-70.

4 王 婷，黄立中，肖玉洁，等.黄芩苷联合黄芩素诱导乳腺癌细胞凋亡的机制研究〔J〕.湖南中医药大学学报，2014;34(5):23-7.

5 El Ali Z，Grzymislawski M，Majewski P，et al.Anti-livin antibodies:novel markers of malignant gastrointestinal cancer〔J〕.Pol Arch Med Wewn，2010;120(1-2):26.

6 Cheung HH，Plenchette S，Kern CJ，et al.The RING domain of cIAP1 mediates the degradation of RING-bearing inhibitor of apoptosis proteins by distinct pathways〔J〕.Mol Biol Cell，2008;19(7):2729-40.