HO-1活性改变对肝癌细胞周期调控因子CKS1和Cyclin D的影响

高 涵 周 涛 陈宏月 张春晶 李淑艳

(齐齐哈尔医学院生物化学与分子生物学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

细胞周期蛋白(Cyclin)D是细胞周期的启动因子，作用于G期，在细胞增殖中发挥着重要作用〔1〕。Cyclin依赖性激酶调节亚基(CKS)1是高度保守的细胞周期调节蛋白(SUCl/CDK)蛋白家族成员之一，能与其他周期蛋白依赖性激酶和磷酸化的蛋白结合，参与细胞周期的调控，与肿瘤的发生、发展密切相关〔2〕。血红素加氧酶(HO)是机体内血红素分解代谢过程中重要的限速酶，包括氧应激诱导型(HO-1)、组成型(HO-2)及尚未明确的HO-3〔3〕。HO-1与肿瘤增殖、凋亡、血管发生等生物学行为密切相关〔4〕。但是目前关于HO-1在肝癌细胞中如何调节细胞周期调控因子尚未见报道。本文对HO-1活性改变对肝癌细胞周期调控因子CKS1和Cyclin D的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1主要材料 人肝癌细胞系HepG2细胞，由北京协和医学院细胞中心提供;脂质体Lipofectamine RNAi MAX、无血清培养基Opti-MEM，购自美国LIFE TECHNOLOGIES公司;胎牛血清，购自杭州四季青有限公司;噻唑蓝(MTT)试剂盒，购自美国Sigma公司;鼠抗人Cyclin D单抗、鼠抗人CKS1单克隆抗体、兔抗人HO-1单克隆抗体、兔抗人三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，购自美国SANTA CRUZ公司;RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂，购自上海生工生物有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒，购自北京鼎国生物有限公司;Trizol试剂，购自美国PROMEGA公司;SYBR Green PCR Reagents，购自美国ABI公司。HO-1 siRNA及荧光标记的siRNA由AMBION公司化学合成(正义:5＇-AACUUUCAGAAGGGCCAGGUGTT-3＇，反义:5＇-CACCUGGCCCUUCUGAAAGUUTT-3＇)。HO-1、cyclin D 和 CKS1 的 PCR 引物由美国LIFE TECHNOLOGIES公司合成。HO-1引物，正义:5＇-TCT CCA AAA TGC CAG AGG CG-3＇，反义:5＇-AGG AAG TTG TTG GGG CTC CT-3＇，产物长度 452 bp;Cyclin D 引物，正义:5＇-GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3＇，反义:5＇-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3＇，产物长度 196 bp;CKS1 引物，正义:5＇-TAC CAC GCA GCA GAG TTT GA GT-3＇，反 义:5 ＇-AGC AAG ATG TGA GGT TCT GG TTC-3＇，产物长度170 bp;GAPDH引物，正义:5＇-GGC ACA GTC AAG GCT GAG AA TG-3＇，反义:5＇-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA-3＇，产物长度 105 bp。

1.2主要仪器 CO2恒温培养箱，购自美国SHELAB;EXL808全自动酶标仪，购自美国BIO-TEK公司;ABI 7500 Real Time PCR System，购自美国ABI公司;KodaK4000 MM显像系统，购自美国CARESTREAM HEALTH公司。

1.3细胞培养 HepG2细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱内培养，培养液为含10%胎牛血清、丙酮酸钠(20 000 U/L)、谷氨酰胺(20 000 U/L)、青霉素(200 000 U/L)和链霉素(0.02 g/L)的MEM培养基，隔天换液，胰蛋白酶消化后进行传代。

1.4细胞转染 将生长状态良好的细胞以6×105/孔接种于6孔板中，将细胞分为转染组、阴性对照组和空白对照组，每组设6个复孔。各组细胞融合度达到80% 进行转染实验，按Lipofectamine 2000试剂盒操作说明书配制质粒和脂质体复合物，转染体系为 200 μl，每孔体积为 500 μl，转染后继续放入 37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱内进行培养，同时设空白对照组和阴性对照组，空白对照组采用培养基代替转染体系，阴性组加入阴性对照表达载体。转染6 h后换为含10%胎牛血清、丙酮酸钠(20 000 U/L)、谷氨酰胺(20 000 U/L)、青霉素(200 000 U/L)和链霉素(0.02 g/L)的MEM培养基继续培养。1.5MTT法测定各组细胞增殖情况 各组细胞转染20 h或44 h时每孔加20 μl浓度为5 mg/ml的MTT继续培养4 h，每孔加入150 μl二甲基亚砜溶解结晶，置摇床上低速振荡10 min后在酶标仪490 nmol/L处测量各孔的吸光度(A)值。

1.6RT-PCR各组细胞HO-1、CKS1和Cyclin D的表达 各组细胞转染48 h后按照说明书提取试剂盒制备总RNA。取RNA样品，用核酸分析仪进行定量，测定260 nm和280 nm的吸光度(A)值，控制 A260/A280在1.9～2.1。RT-PCR按照 SYBR Green PCR Reagents说明书应用ABI 7500 Real Time PCR System进行扩增。扩增反应条件:95℃预变性2 min，94℃ 45 s，64.5℃ 90 s，72℃ 60 s，45 个循环，最后在72℃延长10 min。使用基于内参物GAPDH的相对定量分析，目的基因mRNA表达量用2-⊿⊿Ct计算转录水平的差异。

1.7Western印迹检测CKS1的表达 各组细胞转染后48 h，0.25%胰酶消化细胞并收集至EP管并加入蛋白酶抑制剂。各孔加入RIPA细胞裂解液，收集细胞，离心10 min，用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，超声切割30 s后4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，采用BCA蛋白定量法测各组蛋白浓度。取30 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳。电泳后半干转至聚丙烯酰胺凝胶，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入HO-1、CKS1和Cyclin D抗体孵育，4℃过夜。室温下PBS洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的IgG室温孵育60 min，洗膜缓冲液洗膜3次，进行化学发光，显影、定影。上述反应以β-actin作为内参照，以目标蛋白灰度值与内参灰度值的比值作为其蛋白表达量。

1.8统计学方法 应用SPSS15.0软件进行分析，计量资料以s表示，采用单因素方差分析比较各组间数据差异。

2 结果

2.1各组细胞增殖情况的比较 MTT实验结果显示，HO-1 siRNA转染组细胞转染后24 h和48 h的吸光度较空白对照组显著降低(P＜0.01)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。因此，HO-1 siRNA转染后HepG2细胞增殖能力显著降低，转染后培养24 h或48 h时增殖能力分别较空白对照组降低37.38%和40.54%。见图1。

2.2各组细胞HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA表达的比较HO-1 siRNA转染组细胞转染后48 h的HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA水平较空白对照组显著降低(P＜0.01)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。因此，HO-1 siRNA转染后HepG2细胞HO-1、CKS1和Cyclin DmRNA水平显著降低，转染后培养48 h时HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA分别较空白对照组降低68.51%、21.18%和41.10%。见图2。

2.3各组细胞HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白表达的比较 HO-1 siRNA转染组细胞转染后48 h的HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白水平较空白对照组显著降低(P＜0.01)，而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。因此，HO-1 siRNA转染后HepG2细胞HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白水平显著降低，转染后培养48 h HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白分别较空白对照组降低65.67%、23.08%和40.47%。见图3。

图1 各组细胞增殖情况的比较

图2 各组细胞HO-1、CKS1和Cyclin D mRNA的表达

图3 各组细胞HO-1、CKS1和Cyclin D蛋白表达的比较

3 讨论

肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率居第5位，死亡率居第3位，我国是乙型肝炎大国，肝癌发病人数约占全球的55%，发病率居我国恶性肿瘤第2位〔5〕。由于肝癌早期诊断缺乏有效手段，导致肝癌发现时多数已是中晚期，5年生存率仅为7%〔6〕，探索更加有效的肝癌治疗方案仍是目前肝癌研究的主要目标。HCC的发生是一个多阶段、多步骤、逐渐演变的过程。近几年越来越多的研究表明HO-1参与癌症的发生发展〔7〕。HO-1 在胃腺癌、胶质瘤、乳腺癌等的高表达〔8～10〕。HO-1的过表达与恶性肿瘤的发展和预后密切相关，但目前还没有定论。现已发现癌基因和抑癌基因作用的归结点均在于对细胞周期的调控。实验研究表明，HO-1及其分解产物能影响正常细胞和某些癌细胞的细胞周期〔11〕。但是在肝癌细胞中HO-1如何调节细胞周期调控因子却鲜有报道。

CKS1是周期蛋白依赖性激酶复合物的亚基，是高度保守的细胞周期调节蛋白SUCl/CDK家族成员之一，可以与细胞周期蛋白依赖性激酶相互作用，促进泛素化Cyclin-Cdk抑制蛋白p27kipl的降解，使细胞停滞在G1期，实现其细胞调控功能，从而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，最终抑制肿瘤的发生。研究证明，CKS1在多种类型的肿瘤中过表达，是潜在的肿瘤细胞辐射敏感性调节靶点〔12〕。CKS1在老年HCC组织中的表达与肿瘤细胞的分化程度明显相关，提示CKS1在肝癌的发生发展中可能起着重要的协同作用〔13〕。Cyclin是参与细胞周期调控的主要因子，Cyclin D是一种重要的G1/S期正性调控分子，其基因的结构或功能异常与肿瘤的发生、发展密切相关。原癌基因Cyclin D成于G1早期，是细胞增殖G1-S期的重要控件。已发现多种肿瘤中都有Cyclin D高表达，Cyclin D过调节细胞周期使之始终处于旺盛分裂状态，细胞能够不断分裂增殖而最终形成肿瘤〔14〕。本研究说明HO-1 siRNA转染后肝癌HepG2细胞增殖能力显著降低，因此降低HO-1的活性可显著抑制HepG2细胞的增殖能力。另外，HO-1 siRNA转染可显著抑制肝癌HepG2细胞周期调控因子CKS1和Cyclin D表达，因此推测HO-1对肝癌细胞HepG2增殖作用的影响是通过调控细胞周期因子CKS1和Cyclin D表达而实现。

综上所述，HO-1的活性降低可抑制肝癌HepG2细胞的增殖，其调控作用可能通过降低HepG2细胞CKS1和Cyclin D表达而实现。

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