肝脏活检标本纤维化评估方法的研究进展

赵川 陈虹

·综 述·

肝脏活检标本纤维化评估方法的研究进展

赵川 陈虹

肝纤维化（hepatic fibrosis）是肝脏对抗各种慢性损伤的一种修复反应，其实质是肝组织中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积。长期慢性刺激使纤维化持续发展，最终可发展至肝硬化甚至肝癌，大大增加患者死亡率。病理诊断目前仍然是诊断肝纤维化的金标准，对肝纤维化进行确切地评估不仅有助于掌握疾病严重程度，而且对判断疾病预后、评价治疗效果都有不可替代的作用。目前临床常用的肝纤维化分期的评估系统各具优缺点，随着非线性光学显微技术发展，新的肝纤维化定量分析方法逐渐成熟。本篇文章概述了肝脏活检标本纤维化评估方法研究的新进展。

一、肝纤维化机制

肝纤维化是肝脏各种慢性损伤因素导致的一种共同的病理结局，这些慢性损伤因素包括病毒、肝内胆汁淤积、代谢异常、自身免疫失调、药物及毒物等。肝纤维化实质是细胞外基质（ECM）过度沉积，使正常的肝脏结构发生紊乱，进而造成肝脏功能障碍及肝脏血流动力学异常。

（一）细胞外基质的产生

关于肝纤维化过程中ECM的细胞来源争论已久，最近的研究表明慢性肝损伤中过度积累的ECM来源于多种细胞群，并认为肝脏纤维化细胞（肌成纤维细胞）在这一过程中起关键作用［1］。肌成纤维细胞（myofibroblasts，MFs）来源于肝星状细胞（HSCs）、骨髓来源的肌成纤维细胞、汇管区成纤维细胞、胆管上皮细胞及上皮-间质转换（epithelial mesenchymal transitions，EMT）［2，3］。不同病因所致纤维化具有不同的发病机制，因而参与纤维化的主要细胞也不尽相同。尽管有多种细胞成分可分化为MFs，但起核心作用的细胞仍然是HSCs［4］。

研究发现HSCs起源于中胚层来源的多能间充质干细胞（MMPC）［5］。正常情况下HSCs处于静止状态，细胞中含有大量的维生素A和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。当肝脏受到慢性损伤因素刺激时，凋亡的肝细胞、库普弗细胞、肝窦内皮细胞、浸润的炎细胞、淋巴细胞等分别通过不同机制激活HSCs［1］。活化的HSCs释放出维生素A及GFAP，同时具有了促纤维化、促炎性反应、收缩性、驱化性、增殖性等特点；另外在各种因子刺激下HSCs可以向肌成纤维细胞分化，进而合成并分泌大量ECM参与肝纤维化的形成。

（二）肝纤维化中的细胞外基质

1.细胞外基质对纤维化的正反馈调节

肝纤维化过程中产生的ECM的主要成分是纤维状胶原蛋白，这些胶原蛋白使ECM成为基底膜样而取代了正常的低密度基质［6］。ECM还包括透明质酸、纤连蛋白、蛋白多糖、弹性蛋白等成分。ECM成分能够直接或间接与肝脏细胞相互作用，正反馈调节肝纤维化过程，包括：HSCs的激活、肝细胞微绒毛缺失、肝窦内皮细胞窗孔消失、释放细胞因子等，使肝脏在慢性损伤持续刺激下发生进行性纤维化［7］。

正常情况下异常的细胞外基质可被逐渐降解，这一过程依赖于基质金属蛋白酶（MMPs）和基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）之间的平衡。MMPs能促进ECM的降解，相反，TIMPs不仅抑制MMP对ECM的降解作用，并且抑制HSCs凋亡，促进ECM不断积累［8］。当刺激因素持续存在时，ECM大量积累并且重塑异常，破坏肝脏内环境稳定，使MMPs活性降低而TIMPs活性增加，结果ECM降解减少，大量沉积于肝组织内。

2.细胞外基质对肝脏结构的影响

在正常的肝组织中，细胞外基质存在于肝窦内皮下的Disse间隙中并形成基底膜样结构，正常内皮下基质对维持肝脏内各种细胞的不同功能至关重要。随着肝纤维化的发展，ECM中胶原和非胶原成分可增加至正常的3～5倍，并由低密度型胶原转变为高密度型胶原，使肝窦毛细血管化、肝小叶结构紊乱、假小叶形成，造成肝脏内血流动力紊乱和肝细胞物质交换障碍［9］。

二、组织病理学评估方法进展

肝纤维化是慢性肝脏疾病的一个共同的病理改变。肝纤维化的程度是判断慢性肝脏疾病进展程度和评价疾病治疗效果最好的指标［10］。因此准确、客观地分析肝脏纤维化程度无论对科学研究还是对临床治疗都至关重要［11］。虽然目前肝纤维化的非创伤性评估方法在临床应用增加，包括血清生化诊断、影像学诊断、非创伤性综合指标的诊断模型等，但这些方法仅能定性评估是否存在肝纤维化，或区分轻度肝纤维化与重度肝纤维化，但不能准确的区别肝纤维化的各个阶段。肝脏活检仍然是监测肝纤维化进展的金标准［12］。肝脏活检组织纤维化评估方法经过不断改进，现已广泛应用于临床。随着光学显微技术的发展，新的显微技术能够对肝组织中胶原纤维精确测量，为纤维化评估提供了新的方法。

（一）起始阶段

上世纪60年代末有学者开始对慢性肝病进展程度进行分期［13］，1977年该分期方法进行了改进［14］。1968年首次发表的分期方法将慢性肝炎分为慢性持续性和慢性进展性两种［13］。Popper and Schaffner肯定了肝脏活检在慢性肝炎的诊断和预后判断中的价值，并强调炎症分布区域的描述，包括：慢性小叶、慢性汇管区和慢性汇管周围炎症等，但后者没能体现出病因的重要性［16］。在这一阶段并没有形成系统性的肝纤维化评估方法。

（二）发展阶段

随着对慢性肝脏疾病的病因学、发病机制、病理变化、临床表现等的全面认识，对疾病进展程度的分期更加合理，主要考虑到病因、肝组织的炎症分级和纤维化分期三个因素。1981～1996年间，在原有病理评分方法的基础上进行改进，先后提出了五个慢性肝脏疾病严重程度的病理评分系统：HAI评分系统［17］、Scheuer评分系统［18］、Ishak评分系统［19］、Metavir评分系统［20］和Ishak改进的HAI系统［21］。目前广泛应用于临床。

以上评估方法虽然能够较为系统、客观的对纤维化程度作出半定量评估，但这些评分系统基本上都是以慢性病毒性肝炎为模型建立的，应用于其他病因所致肝纤维化的评估时有不同程度的局限性［22］。此外，上述方法是基于对肝组织病理切片的免疫组化染色结果的阅读，由病理专家给出评分。因此除了肝脏穿刺活检固有的创伤性之外，传统的纤维化评估方法还存在读片者本身及读片者之间的主观性差异、染色剂浓度影响及光漂白等缺点，使客观性、精确性、可重复性等受到影响。

（三）新进展阶段

近年来有文献报道应用非线性光学显微技术——二次谐波产生（SHG）和双光子激发荧光（TPEF），结合计算机分析系统对肝活检标本进行全自动纤维化评估的方法［23］。这种方法基于肝组织自身荧光的存在，不需染料染色，克服了传统评估方法的很多缺点，能够更加准确、客观、定量、快速地对纤维化做出评估。

1.SHG/TPEF光学原理简介

外部可调节的锁模蓝色激光共聚焦图像系统是SHG/ TPEF的技术基础，如图1所示。激光首先通过脉冲压缩器（PC）和声光调节器（AOM），分别用来减少激光的全速分散和能量衰变。然后激光经分色镜（DM），被折射的部分激光通过物镜到达非染色组织切片。组织中产生的TPEF位置指示信号被该物镜收集，并通过一个分色镜和一个500～550 nm波长的带通滤波片后被光电倍增管（PMT）记录。SHG信号被一个聚光器收集，并在被PTM检测前经450nm波长的电通滤波片滤过。由于这种非线性光学过程内在的光学选择特性，不需使用共聚焦显微镜的针孔作用［24］。

2.组织标本图像的采集、处理优势

利用胶原的内在特性，SHG显微技术可以更加敏感地获取非染色肝组织中胶原的定量信息。其优点是能够检测到胶原结构及其在纤维化早期的重塑过程［25］。另有研究发现，抗纤维化治疗后肝组织在传统组织评分中未能发现明显变化而SHG显微技术则能检测到胶原减少［26］。不仅如此，SHG显微成像能够描述组织切片中胶原的三维空间分布，可以精确描述胶原蛋白在不同区域的增加强度［27］。将SHG显微技术与计算机系统相结合，可将组织图像转化为数字化信息，实现胶原的全自动定量分析。

图1

在激光下肝细胞内分子（NADPH、黄素等）产生的大量荧光可被TPEF记录。肝损伤过程中由于肝细胞变性、坏死而使细胞核、胞浆、脂滴聚集区域缺乏荧光颗粒，在TPEF中显示为暗区，因而TPEF适用于肝细胞形态的观察［28］。

目前已有商品化的SHG/TPEF显微仪器，可方便快速地采集组织信息并将组织图像信息转化成数字图像与计算机相结合，直接分析组织切片中胶原和坏死性炎症的情况［29］，对肝纤维化程度进行评估。新的纤维化评估方法具有以下优点：不需要组织染色和人工阅读病理切片，避免了染色剂、观察者的影响而具有更好的可重复性；可根据不同病因所致纤维化模型调整分析参数、建立模型，使评估更加标准化；可将成像系统与计算机相连结合，实现全自动定量评估；可以获得胶原的三维空间结构及分布信息，使评估更加精确、连续。

三、小结与展望

肝纤维化是不同病因所致慢性肝脏疾病的一个共同的病理过程，其实质是肝组织中ECM的过度积累。为判断疾病严重程度、评价治疗效果、判断预后，必须准确、客观地评估肝脏纤维化情况。传统的评估方法各具优缺点，SHG/TPEF显微技术不仅克服了传统方法的部分缺点，而且具有更多优势。

目前已有SHG/TPEF用于临床慢性乙型肝炎肝纤维化的病理评估模型的报道，可用于乙肝肝纤维化评估，相信该技术会很快应用于其他病因所致肝纤维化的评估中。另外由于SHG/TPEP的灵敏性、连续性等特点，不仅可用于疾病诊断、分期，还使治疗效果的检测更准确，并有助于新的抗纤维化药物研发和优化病人个体化治疗方案。

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2014-12-19）

（本文编辑：魏清）

100039 武警总医院移植研究所

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