HBx与p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相关性肝细胞癌中的表达

王宏利 沙小莹 郭雅玲 张新昀 罗改云

HBx与p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相关性肝细胞癌中的表达

王宏利 沙小莹 郭雅玲 张新昀 罗改云

目的 探讨HBVx蛋白（HBV x protein，HBx）与p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相关性肝细胞癌中表达的相关性。方法 通过乙肝相关性肝细胞癌组织的病理标本和转染乙肝病毒（HBV）x基因的人肝细胞株两部分试验，分别检测HBx、Smyd2、p300/CBP的表达，分析HBx、Smyd2、p300/CBP之间表达的相关性。结果 较之癌旁组织，肝癌组织中HBx的表达显著增高，Smyd2、p300/CBP的表达则显著下调，差异均有统计学意义，（均P＜0.05）。且经Pearson相关性分析，HBx与Smyd2和p300/CBP在乙肝相关性肝细胞癌中的表达具有较高的一致性（P＜0.05）。结论 HBx与p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相关性肝细胞癌中的表达之间有一定相关性。

乙肝相关性肝细胞癌；HBV X蛋白；p300CBP；Smad2；相关性

乙型肝炎病毒（HBV）会导致原发性肝细胞癌（HCC）的发生，对人体的危害极大［1］。其中，HBV的x基因编码的HBVx蛋白参与了HCC发生，并具有十分重要的作用。p53是一种细胞凋亡调节基因，可以诱导DNA损伤的细胞发生凋亡。从而达到清除基因损伤细胞，阻止细胞转化的目的［2］。p53在突变之后可以发挥出抗凋亡的作用，并在HCC中呈现出不同的表达。本研究用免疫组织化学的方法分别检测了HCC组织及癌旁组织中HBx、Smyd2、p300/CBP的表达。探讨HBVx蛋白（HBV x protein，HBx）与p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相关性肝细胞癌中表达的相关性。现将研究结果报道如下。

资料和方法

一、一般资料

收集肝癌及癌旁组织标本各40份，所有病例临床和病理资料均完整，标本经10%Formalin固定，石蜡包埋，并予以5μm连续切片。研究获得医学伦理学相关部门同意。

二、方法

体外实验：构建表达乙肝病毒（HBV）X基因的人肝细胞株，用未表达乙肝病毒（HBV）X基因的人肝细胞株作为阴性对照。应用免疫组织化学的方法分别检测HCC组织及癌旁组织中HBx、Smyd2、p300/ CBP的表达。用到的试剂有：抗p300CBP抗体（购自：晶美公司）、抗Smad2抗体（购自：Santa Cruz公司）、S-P试剂盒、DAB试剂盒（均购自：北京中山生物技术开发公司）。

三、判定标准

参照蒋成英等［3］的判断标准，染色强度判断：（1）0分：细胞不着色；（2）1分：浅黄色；（3）2分：棕黄色；（4）3分：棕褐色。阳性细胞计数：随机选择5个高倍视野，（1）0分：染色细胞小于5%；（2）1分：染色细胞为5%～24%；（3）2分：染色细胞为25%～49%；（4）3分：染色细胞为50%～74%；（5）4分：染色细胞大于75%。阳性细胞计数乘以染色强度得分，（1）阴性：0分；（2）弱阳性（+）：1～4分；（3）中度阳性（++）：5～8分；（4）强阳性（+++）：9～12分。

四、统计学处理

研究所得数据均输入Excel表格，建立数据库，并使用SPSS公司推出的SPSS 13.0软件进行统计分析，研究所得计数资料均进行χ2检验，计量资料均进行t检验，并以进行表示。并对P值进行检测，P＜0.05，差异有统计学意义。

结 果

经统计和比较，两组各基因蛋白表达情况存在差异，且经比较差异均有统计学意义，（均P＜0.05）。且经Pearson相关性分析，HBx与Smyd2和p300/CBP在乙肝相关性肝细胞癌中的表达具有较高的一致性（P＜0.05）。具体结果如表1所示。

表1 两组各基因蛋白表达情况分析

表1 两组各基因蛋白表达情况分析

观察项目癌旁组织肝癌组织P 05 Smyd2 15.2297±0.8871 5.7027±0.6330＜0.05 p300/CBP 12.9769±0.9274 5.2635±1.0047＜0. HBx 0.7281±0.2131 1.5591±0.2672＜0. 05

讨 论

HBV在世界范围内传播，估计全球感染者及携带者达3.5亿之多，其中约有1.3亿人在我国［4］。

HBV作为常见的人类易感病原体，和多种肝脏疾病之间存在十分密切的联系，例如肝炎和肝纤维化以及肝癌等。尤其在乙肝相关性HCC相关发生机制的研究过程中，经常会涉及到各种致癌基因和生长因子以及肿瘤抑制因子还有相关信号通路等［5］。研究发现，HBx可以通过与肝细胞核内外各种蛋白分子的相互作用对肝细胞造成各种影响，例如影响癌基因、抑癌基因的表达及活性，最终导致肝细胞的癌变［6］。

p53是一种抗癌基因，因编码一种分子质量为53k Da的蛋白质而得名。p53蛋白质能够遏制细胞的增殖，具有遏制癌细胞的作用，可以作为重要的转录因子调控150多种基因的表达［7，8］。p53是机体内最重要一种抑癌因子，当p53正常发挥功能时，它参与细胞分裂的调控。而当某些原因例如基因突变使得p53蛋白功能出现异常时，则会引起失控性细胞分裂最终有可能导致癌症发生［9］。HBx与P53相互作用关系一直是乙肝相关性肝细胞癌研究中的热点问题，陈钊宏等［10］通过IHG特殊免疫组织化学法检测手术切除经病理证实为原发性肝癌的HCC组织及正常肝组织中AFB1-DNA加合物的暴露情况，并按照是否同时存在HBV暴露进行分组，并对各组间p53蛋白的表达情况利用免疫组化S-P法检测进行比较，并检测其p53基因第7外显子249密码子的突变情况。最终结论认为，HCC的发生过程中AFB1暴露与p53第7外显子249位点的突变密切关系相关。如果同时存在乙肝病毒暴露的协同作用的情况下突变率更高，p53基因的突变可能是造成HCC中p53蛋白高表达的重要因素之一。近年来，随着表观遗传学的发展，人们将组蛋白的研究发现应用于p53的研究，发现可能多种类型的翻译后修饰作用调节了p53的稳定，从而影响了P53的多种功能。这种蛋白修饰对于P53功能的影响与肝癌的形成以及乙肝病毒在这种修饰中的作用是目前研究的发展趋势。Smyd2是一种甲基转移酶，可以对p53蛋白进行修饰。Smyd2蛋白的修饰位点为Lys370。Smyd2蛋白通过在Lys370位点对p53蛋白进行甲基化修饰，可以有效的对p53的转录激活功能予以抑制［11］。因此，同组蛋白一样，Lys残基的甲基化修饰同样会对p53的转录功能产生影响，对其产生激活或者抑制。这也是少数的在组蛋白以外的蛋白中发现的，通过甲基化可以对其蛋白活性进行调节的实验［12］。乙酰化会对p53依赖的细胞凋亡反应产生十分重大的影响，并对积极的影响到p53的稳定性。如果DNA出现损伤，CBP并会联合p300一起进行作用，保持p53的稳定性，并显著提高其与特异DNA序列进行结合的能力［13］。另外，CBP还可以和p300共同作用，促使MDM2的乙酰化，从而有效降低MDM2对p53的泛素化作用，促进p53稳定性的提高［14，15］。本研究最终结果显示，较之癌旁组织，肝癌组织中HBx的表达显著增高，Smyd2、p300/ CBP的表达则显著下调，差异均有统计学意义，（均P＜0.05）。提示Smyd2、p300/CBP的低表达可能促进了肝癌的发生和发展。且研究结果还显示，经Pearson相关性分析，HBx与Smyd2和p300/CBP在乙肝相关性肝细胞癌中的表达具有较高的一致性。即说明，Smyd2、p300/CBP的低表达与HBx的表达之间存在一定的联系，关于具体的影响机制，值得在今后的研究中予以进一步分析探讨。

综上所述，HBx与p300CBP、Smad2蛋白在乙肝相关性肝细胞癌中表达之间具有一定的相关性，可以用于对乙肝与肝癌发病关系的研究，以更好的探索肝癌的防治措施，指导临床治疗。

1 洪清琦.HBx在乙肝相关性肝癌中的表达与临床意义及其调控组蛋白甲基转移酶SMYD3表达的机制研究.中山大学，2010.

2 何云，牛子长，梁红霞，等.HBVX蛋白及血管生成素-2与乙型肝炎相关性肝细胞癌的关系研究.传染病信息，2012，25：276-277，291.

3 蒋成英，陈丽，戴广海.肝细胞癌中survivinEGFR和VEGF的表达及临床意义.临床肿瘤学杂志，2010，15：779-783.

4 龚玲，景钊，邹长林，等.乙肝相关性肝癌组织中p27、p53及增殖细胞核抗原的表达.中国基层医药，2007，14：96-98.

5 王兰天.乙肝病毒相关性肝细胞癌发生机制.国际病毒学杂志，2010，17：178-183.

6 吴武佳，陈李影慧，宋晨源，等.CCRK在肝细胞癌组织中的表达及其与HBx的关系.军事医学，2013，37：110-113.

7 崔利园，张钊瑞，费洪荣，等.乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白促进HepG2细胞迁移并调节β-catenin表达.中国病理生理杂志，2012，28：1128-1131.

8 孙长宇.乙肝病毒X基因在肝细胞癌发生发展中作用及机制.郑州大学，2011.

9 Dai Y，Cros MP，Pontoizeau C，et al.Dow nregulation of transcription factor E4F1 in hepatocarcinoma cells：HBV-dependent effects on autophagy，proliferation and metabolism. Carcinogenesis，2014，35：635-50.

10 陈钊宏，黎乐群，齐鲁楠，等.乙肝病毒/黄曲霉毒素B1双暴露相关性肝细胞癌的p53基因249位点突变与p53蛋白表达的关系.中国癌症防治杂志，2011，03：1-5.

11 祝玲玲，朱平安，蔡兰兰，等.乙肝病毒HBx-d382与HBx-d431突变体特异性抗体检测方法的建立及临床应用.中南医学科学杂志，2014，280：262-264.

12 Feitelson M A，Bonamassa B，Arzumanyan A.The roles of hepatitis B virus-encoded X protein in virus replication and the pathogenesis of chronic liver disease.Expert Opin Ther Targets，2014，18：293-306.

13 Kim JH，Alam MM，Park DB，et al.The Effect of Metformin Treatment on CRBP-I Level and Cancer Development in the Liver of HBx Transgenic Mice.Korean J Physiol Pharmacol，2013，17：455-461.

14 闪明海，胡爱丽，杨琴，等.宁夏地区乙型肝炎病毒基因BCP区A1762T/G1764A突变与肝细胞癌的相关性.宁夏医科大学学报，2014，36：148-150.

15 刘海鸥.乙型肝炎病毒大S蛋白（LHBs）和X蛋白（HBx）对肝癌发生的转移的调控及其功能的研究［D］.复旦大学，2012.

2014-09-16）

（本文编辑：冯珉）

陕西省科学技术研究发展计划项目 项目编号：2014K11-01-01-15

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