慢性乙型肝炎患者病毒载量与IFN-γ、IL-10、CD19+水平的相关性

吴敏

·临床与基础研究·

慢性乙型肝炎患者病毒载量与IFN-γ、IL-10、CD19+水平的相关性

吴敏

目的 探讨IFN-γ、IL-10、CD19+水平与慢性乙型肝炎患者病毒载量的相关关系。方法 收集感染科2012年6月到2014年2月的门诊及住院的慢性乙型肝炎患者80例，同时选取在我院体检正常或者非肝炎病毒感染患者50例作为对照组，荧光定量PCR法定量病毒载量，酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体法检测IFN-γ、IL-10水平及荧光染色测定CD19+水平，分析IFN-γ、IL-10、CD19+水平与HBV DNA定量相关关系。结果 病例组的IFN-γ水平低于对照组，而IL-10与CD19+高于对照组中的水平，差异具有统计学意义（P＜0.05）。HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平在HBV DNA阴性、低拷贝、高拷贝间差别具有统计学意义（P＜0.05），其中高拷贝与低拷贝组中HBV DNA定量、IL-10及CD19+水平高于HBV DNA阴性组中水平，IFN-γ低于HBV DNA阴性组中的水平，差异具有统计学意义（P＜0.05），高拷贝HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平与低拷贝间差别具有统计学意义（P＜0.05）。IFN-γ与HBV DNA定量间呈负相关关系（r=-0.367，P＜0.05），IL-10和CD19+水平与HBV DNA定量间呈现正相关关系（IL-10 r=0.362、CD19+r= 0.348，P＜0.05）。结论 IFN-γ水平与慢性乙型肝炎患者病毒载量呈现负相关关系、IL-10、CD19+水平与慢性乙型肝炎患者病毒载量间呈现正相关关系，因此IFN-γ、IL-10、CD19+水平可以作为乙型肝炎患者发生炎症特异指标。

IFN-γ；IL-10；CD19+水平；慢性乙型肝炎患者；相关性

乙型肝炎是严重血液传播性疾病，在世界各地均有发生，据统计全世界超过一半人感染过乙型肝炎病毒，而我国是高发地区，危害严重［1］。乙型肝炎分为慢性和急性两种类型，而超过多一半的为慢性乙型肝炎［2］。慢性乙型肝炎是指乙型肝炎病毒检测为阳性，病程超过半年或发病日期不明确并且临床为临床表现为乏力、畏食、恶心、腹胀、肝区疼痛等症状者［3］，乙型肝炎可以发生各个年龄段，主要传播途径有血液传播、性传播、母婴传播，一般得了都难以治愈，严重威胁者人们的生活质量和生命健康。现在大部分研究表明乙型肝炎病毒对肝伤害是通过介导免疫损伤后间接对肝造成损伤［4］，所以研究免疫因子与病毒载量间关系至关重要。现将我院感染科收集的2012年6月至2014年2月的门诊及住院慢性乙型肝炎患者80例，应用相应检测方法分析病毒定量与IFN-γ、IL-10、CD19+水平相关性，报道如下。

资料和方法

一、一般资料

收集我院感染科2012年6月到2014年2月的门诊及住院的慢性乙型肝炎患者80例，其中男47例，女33例，年龄在20～75岁，平均（47.38±4.79）岁，病程2月～2年，平均（1.23±022）年。同时选取在我院体检正常或者非肝炎病毒感染患者50例作为对照组，其中男26例，女24例，年龄在19～70岁，平均（46.23 ±4.37）岁。纳入标准：①所有患者均符合慢性乙型肝炎临床诊断金标准，即符合第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议上通过的《慢性乙型肝炎防治指南》。②患者不合并其他严重并发症，或者内分泌性疾病，或者恶性肿瘤等疾病，未服用可能对研究的指标有影响的药物，比如未抗病毒治疗等。③慢性乙型肝炎病毒感染不合并其他肝炎病毒感染，以及没有肝脏疾病史。④符合伦理道德，家属或者患者签署了知情同意书等。排除标准：①患有严重器官衰竭性疾病，或者内分泌性疾病，比如：肝肾衰竭、糖尿病等。②患者正在接受抗病毒治疗，以及合并其他肝炎病毒感染，同时可能患有影响IFN-γ、IL-10、CD19+水平的非肝炎疾病。③对本次研究不依从、不配合以及拒绝参加试验者，或者研究过程中不按照规定进行检查，或者在调查过程中采用了其他的治疗的措施的患者及转院治疗患者。④在治疗过程中病情突然的加重不能在参加试验的。病例组和对照组，一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

二、仪器与试剂

美国biotek酶标仪、流式细胞检测仪（贝克曼EpicsXL检测系统）、荧光检测仪（荧光定量核酸检测仪）、离心机（贝克曼库尔特Optima XPN）；ELISA双抗体检测试剂盒（IFN-γ：郑州安赛生物科技有限公司、IL-10试剂盒：上海西唐生物科技有限公司）、CD19+藻红蛋白（PE）单抗试剂（美国COULTER原装配套）、杜邦聚合酶链反应（PCR）试剂盒、达安DA7600 PCR仪、乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝剂、HBV DNA定量检测试剂盒（珠海赛乐奇生物技术有限公司）。

三、研究方法

（一）标本来源

采取患者空腹静脉血4 m L，3 000 r/min离心10 min，留取上层血清，-70℃保存待用；再采取2 m L EDTA-K2抗凝静脉血用于检测CD19+。

（二）HBV DNA水平定量检测

应用荧光定量PCR法，仪器为达安DA7600 PCR仪。具体步骤：①血样RNA的抽提：解冻；提取血清细胞；两相分离（离心后混合液体将分为下层红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层）。RNA沉淀（RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块）；RNA清洗；RNA干燥；溶解RNA沉淀。②RNA质量检测：紫外吸收法测定，先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1∶100）后，读取其在分光光度计260 nm和280 nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。③样品cDNA合成：逆转录buffer 2μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL、d NTP 0.1μL、逆转录酶MMLV 0.5μL、DEPC水5μL、RNA模版2μL、总体积10 μL。④样品管家基因实时定量PCR。⑤模板，针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。⑥PCR，所有c DNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。⑦引物设计（应用Primer Premier 5.0软件）。⑧电泳，各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，Gold View染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。结果判断：≥103拷贝/mL为阳性（低拷贝：103～106拷贝/ mL，高拷贝：＞106拷贝/mL），＜103拷贝/m L为阴性。

（三）IFN-γ、IL-10、CD19+水平检测

IFN-γ、IL-10水平检测：ELISA双抗体法检测，严格按照试剂盒使用说明书操作，使用酶标仪450 nm检测吸光度值，通过标准曲线计算标本中的浓度。CD19+水平检测：严格按照操作说明进行，首先100μL抗凝血于试管中，加入20μL PE荧光标记抗体，室温反应20 min，加入一定量细胞裂解液，反应15 min，加入500μL鞘液混匀，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入500μL鞘液，混匀后检测染色阳性，计算CD19+水平。

四、研究指标

病例组与对照组IFN-γ、IL-10、CD19+水平比较；IFN-γ、IL-10、CD19+水平与HBV DNA水平之间相关性关系。

五、统计学方法

应用SPSS13.0统计分析软件进行，计量资料以均值±标准差表示，检验符合正态分布的，行两组之间的t检验，多个均值间比较应用方差分析；计数资料用百分比表示，采用卡方检验（χ2）；应用pearson检验分析IFN-γ、IL-10、CD19+水平与HBV DNA之间相关关系。取P＜0.05时差异具有统计学意义。

结 果

一、两组IFN-γ、IL-10、CD19+水平及基础指标比较

病例组和对照组性别、年龄等基础指标之间差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性；病例组的IFN-γ水平低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），而IL-10与CD19+高于对照组中的水平，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

二、IFN-γ、IL-10、CD19+水平与病毒载量之间相关关系

经过HBV DNA定量检测80例患者中其中HBV DNA阴性（＜103拷贝/m L）23例、HBV DNA阳性（≥103拷贝/mL）57例，其中低拷贝的29例，高拷贝的28例。HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平在三种类型之间差别具有统计学意义（P＜0.05），其中高拷贝与低拷贝组中HBV DNA定量、IL-10及CD19+水平高于HBV DNA阴性组中水平，IFN-γ低于HBV DNA阴性组中的水平，差异具有统计学意义（P＜0.05），高拷贝HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平与低拷贝间差别具有统计学意义（P＜0.05），见表2。IFN-γ与HBV DNA定量间呈现负相关关系（r=-0.367，P＜0.05），IL-10和CD19+水平与HBV DNA定量间呈现正相关关系（IL-10r= 0.362、CD19+r=0.348，P＜0.05），见图1、2、3。

表1 两组IFN-γ、IL-10、CD19+水平及基础指标比较

表1 两组IFN-γ、IL-10、CD19+水平及基础指标比较

?

表2 HBV DNA对数定量与IFN-γ、IL-10、CD19+水平关系

表2 HBV DNA对数定量与IFN-γ、IL-10、CD19+水平关系

注：*与HBV DNA阴性间比较P＜0.05；#与低拷贝间比较P＜0.05

类别例数HBV DNA定量（拷贝/mL）IFN-γ（pg/m L）IL-10（pg/mL）CD19+（%）HBV DNA阴性23 3.12±1.24 726.24±235.18 427.28±127.89 10.89±2.26低拷贝29 5.78±1.35*613.27±220.75*564.25±144.67*13.15±2.31*高拷贝28 7.61±1.69*#421.37±198.35*#756.26±154.37*#15.58±3.15*#F -10.234-16.235 21.235 14. 000 231 P -0.001 0.000 0.000 0.

图1 HBV DNA对数定量与IFN-γ间散点图

图2 HBV DNA对数定量与IL-10水平间散点图

图3 HBV DNA对数定量与CD19+水平间散点图

讨 论

乙型肝炎病毒感染是所有肝炎中占有比例最高的，也是影响人们生命质量最重要的一种，现在临床上对于乙型肝炎的研究也较多，从它的发生发展各个方面都有所深入，但是对于HBV引起肝脏病变如何损伤机体还没有一个明确认识［5］。大量文献资料表明只有HBV引起免疫损伤才能出现肝脏病变，细胞免疫、体液免疫及可能出现的自身免疫相互关联参与发病才能引起疾病，不同疾病类型以不同的免疫反应为主［6-7］。对于慢性肝炎主要是由于细胞免疫异常导致，有三种效应细胞分别为自然杀伤细胞（NK）、细胞毒性T细胞（TC）及抗体依赖淋巴细胞［8］。其中免疫调控细胞即辅助性T细胞（TH）与抑制性T细胞（TS）其功能低下或亢进均引起免疫紊乱。辅助性T细胞（TH）分为Th1和Th2亚群，Th1分泌IFN-γ、IL-10等细胞因子介导细胞免疫，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子，可介导体液免疫，而CD19+与B淋巴细胞有关［9-10］，所以研究血液中病毒载量与细胞因子之间关系对于临床诊断和治疗有很大的作用。

本文收集我院感染科2012年6月到2014年2月门诊及住院的慢性乙型肝炎患者80例，以及选取我院体检正常或者非肝炎病毒感染患者50例作为对照，应用荧光定量PCR法定量病毒载量，ELISA双抗体法检测IFN-γ、IL-10水平及荧光染色测定CD19+水平，分析IFN-γ、IL-10、CD19+水平与HBV DNA定量相关关系。结果显示病例组的IFN-γ水平低于对照组，而IL-10与CD19+高于对照组中的水平，差异具有统计学意义（P＜0.05），IFN-γ水平降低、IL-10与CD19+升高说明患者同时发生了细胞免疫和体液免疫。HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平在HBV DNA阴性、低拷贝、高拷贝间差别具有统计学意义（P＜0.05），可能说明病毒含量越高刺激机体发生免疫反应越严重，当机体不能耐受就会造成相应危害，其中高拷贝与低拷贝组中HBV DNA定量、IL-10及CD19+水平高于HBV DNA阴性组中水平，IFN-γ低于HBV DNA阴性组中的水平，差异具有统计学意义（P＜0.05），高拷贝HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平与低拷贝间差别具有统计学意义（P＜0. 05）。IFN-γ与HBV DNA定量间呈负相关关系（r= -0.367，P＜0.05），IL-10和CD19+水平与HBV DNA定量间呈现正相关关系（IL-10 r=0.362、CD19+r=0.348，P＜0.05），这些指标与病毒载量之间关系只是在小样本特定地区群体中的关系，现在也没有一个世界性多中心的相关研究，所以结果可供参考。

综上所述，IFN-γ水平与慢性乙型肝炎患者病毒载量呈现负相关关系、IL-10、CD19+水平与慢性乙型肝炎患者病毒载量间呈现正相关关系，因此IFN-γ、IL-10、CD19+水平可以作为乙型肝炎患者发生炎症特异指标，可以通过检测这些指标变化推断病毒载量的情况及感染情况，进而可以制定相应的治疗和预防措施。

1 吴晓瑛，喻剑华，施军平，等.慢性乙型肝炎患者血清HBs Ag水平与HBe Ag、HBV DNA载量的关系.中国医刊，2013，46：47-49.

2 刘社琴.乙肝血清标志物与HBV DNA定量检测结果分析.中国医药导报，2011，8：171-172.

3 陈永琴，金文君，戴梦璐.慢性乙型肝炎患者IFN-γ、IL-10和CD19+水平水平检测与病毒载量的关系.检验医学，2013，28：315-318.

4 谭昀，张咏梅，李伏君.乙型肝炎HBV DNA检出阳性率及病毒复制水平与乙型肝炎两对半模式间的关系分析.当代医学，2014，20：17-19.

5 Abhishek Das，Matthew Hoare，Nathan Davies，et al.Functional skewing of the global CD8+T cell population in chronic hepatitis B virus infection.J Exp Med.2008，205：2111-2124.

6 王京旭，魏平，王俊祥，等.类风湿关节炎患者外周血CD23+/CDl9 +细胞表达状况的研究.临床荟萃，2009，24：2031-2033.

7 Bei Zhong，Mao Ping Huang，Guo Qing Yin，et al.Effects of costimulation on intrahepatic immunopathogenesis in patients with chronic HBV infection.Inflamm Res，2014，63：217-229.

8 Junyan Feng，Lu Lu，Cong Hua，et al.High Frequency of CD4+ CXCR5+TFH Cells in Patients with Immune-Active Chronic Hepatitis B.PLoS One，2011，6：21698.

9 Xing TJ，Xu HT，Yu WQ，et al.MiRNA-548ah，a Potential Molecule Associated with Transition from Immune Tolerance to Immune Activation of Chronic Hepatitis B.Int J Mol Sci，2014，15：14411-14426.

10 Du WJ，Zhen JH，Zeng ZQ，et al.Expression of Interleukin-17 associated with disease progression and liver fibrosis with hepatitis B virus infection：IL-17 in HBV infection.Diagn Pathol，2013，28：40.

2014-11-06）

（本文编辑：冯珉）

201508 上海市金山区复旦大学附属金山医院临床检验科