紫外-可见分光光度法测定八爪金龙中总皂苷的含量

樊丹怡，常 宏，邹 嵘，邓少洁，蒋绍艳，何 珊(深圳市妇幼保健院药剂科，广东深圳 518028)

八爪金龙［Ardisia crispa(Thunb.)A.DC.］是紫金牛科紫金牛属植物，以根及叶入药，一般夏、秋季采集。八爪金龙具有清热祛痰、散瘀消肿的功效，用于咽喉痛、扁桃腺炎、肾炎水肿及跌打风湿等症，又可用于白浊、骨结核、咳血、蛇咬伤等［1］。作为一种苗族特色药，八爪金龙的水煎液可用于治疗慢性咽炎、疮肿，尤其对咽炎的效果显著［2］。前期研究结果表明，八爪金龙中含大量皂苷类成分，且具有抗菌活性。但关于八爪金龙质量控制方面的文献较少，本研究拟利用紫外-可见分光光度法测定八爪金龙中总皂苷的含量，以期为进一步开发八爪金龙药材提供质量监控的方法。

1 材料

1.1 仪器

AR1530/C型电子分析天平(奥豪斯上海有限公司)，RE-210E型旋转薄膜蒸发仪(巩义市予华仪器有限公司);UV-7540紫外可见分光光度仪(上海精科实业有限公司)，数显电热恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，KO-508E型超声仪(广州市超声仪器有限责任公司)。

1.2 药品与试剂

八爪金龙药材(购于贵阳市太升中药市场);乙醇、乙醚、高氯酸、冰醋酸、正丁醇等化学试剂均为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)。

2 方法与结果

2.1 测定方法的依据

选用从八爪金龙中分离的含量较高的百两金皂苷B(纯度达99.0%)为对照品，测定八爪金龙提取物中总皂苷的含量。测定依据为皂苷和皂苷元与香草醛高氯酸反应后产物在可见区有稳定的特征吸收。

2.2 对照品、供试品溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备:取百两金皂苷B对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 ml溶液含百两金皂苷B对照品0.2 mg，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备:称取八爪金龙药材粗粉0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入石油醚20 ml，超声提取20 min，过滤，保留滤渣和滤纸，再加入石油醚20 ml，超声提取20 min，重复操作2次，挥干滤渣和滤纸;再向具塞锥形瓶中加入甲醇20 ml，超声提取20 min，滤过，向滤纸和滤渣加入甲醇10 ml，保留滤液，再重复操作2次，合并滤液;将滤液挥干得到滤渣，先用20 ml水溶解，将液体转入分液漏斗中，用20 ml水饱和正丁醇萃取2次，收集水层，合并正丁醇液，蒸干，用甲醇溶解，并定容至100 ml容量瓶中至刻度，即得。

2.3 测定波长的选择

精密吸取对照品溶液和样品溶液各0.5 ml置于具塞试管中，挥干溶剂，各加入5%香草醛-冰醋酸(V∶V=5∶100)0.2 ml和高氯酸1 ml，摇匀，至80℃水浴中反应30 min，取出，冰浴10 min终止反应;精密加入冰醋酸10 ml，以不加样品的为空白对照，在紫外-可见分光光度计上于400～700 nm波长范围内进行扫描，其在546 nm处有最大吸收，故选取546 nm为测定波长。

2.4 比色条件的优化

取供试品溶液适量，以吸光度为指标，采用正交试验设计优化显色条件，主要考察4个因素，见表1。设计L9(3)4正交试验表进行分光光度法测定，结果见表2。对正交试验结果进行分析，由分析结果的R值可推断出4个因素的重要性顺序为A＞C＞B＞D，最佳的实验条件为:A3B2C3D2，即加5%香草醛-冰醋酸(V ∶V=5 ∶100)0.6 ml和高氯酸 1.0 ml，于80 ℃ 水浴中反应20 min，冰浴终止反应。

表1 试验因素与水平Tab 1 Levels of experimental factors

表2 正交试验设计与结果Tab 2 Results of orthogonal tests

2.5 方法学考察

2.5.1 线性及线性范围:精密吸取对照品溶液0.0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 ml置于具塞比色管中，挥干，按照“2.4”项方法显色操作，加入冰醋酸5 ml摇匀，以首管为空白对照，于546 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。得回归方程:Y=44.87X+0.365(r=0.998)，结果显示，百两金皂苷B在0.0452～3.8700 mg范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.5.2 稳定性考察:精密吸取同一对照品溶液，以溶剂空白为对照，按照“2.4”项方法显色操作，加冰醋酸至5 ml，分别在10、20、30、40、60、90 min 测定其吸光度，RSD=1.78%。结果显示，该显色方法产物在90 min内稳定。

2.5.3 精密度试验:精密吸取同一对照品溶液，以高氯酸为空白对照，在于546 nm处测定吸光度值。结果显示，百两金皂苷B的RSD=1.23%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验:精密称取药材适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，同法测定，测得总皂苷含量的RSD=1.23%(n=6)，表明该方法的重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验:精密称取9份已知皂苷总含量的八爪金龙药材，分为高、中、低浓度3组，分别精密加入已知总皂苷含量的80%、100%、120%的百两金皂苷B对照品，同法处理，测得百两金皂苷 B的平均回收率为101.3%，RSD=1.67%，表明该方法准确度符合要求，见表3。

表3 百两金皂苷B加样回收率试验结果(n=9)Tab 3 Results of recovery experiment of Ardisiacrispin B(n=9)

2.5.6 样品中总皂苷的测定:精密称取3批八爪金龙药材，按照上述供试品溶液的方法各制备5份供试品溶液，在546 nm处测定吸光度值，用标准曲线法计算八爪金龙中总皂苷含量，结果显示，3批八爪金龙中总皂苷含量分别为6.784%(RSD=2.03%)、7.521%(RSD=1.56%)、7.052%(RSD=2.85%)。

3 讨论

中药是一个多组分的复杂体系，具有多种化学成分。考虑到检测的成本与可行性，以某一类主要成分的含量作为检测指标可建立药材快速、简单的质控方法。

本实验拟对八爪金龙药材进行深入系统研究，利用香草醛-高氯酸比色法对其中主要成分总皂苷建立含量测定方法。研究中曾比较香草醛-冰醋酸-高氯酸和香草醛-乙醇-高氯酸比色法，结果显示，香草醛-乙醇-高氯酸法显色过快，难以控制;而香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法显色明显，无干扰，显色稳定，故采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法进行测定。本研究选择百两金皂苷B为对照品是因为该成分具有抗炎、抗肿瘤等多种药理活性，性质稳定，作为含量测定的指标成分具有代表性［3-4］。

紫外-可见分光光度法作为一种常用的分析方法，在中药质量分析中得到了大量应用［5-7］。其具有快速、简单、良好的稳定性和重现性及结果准确的优点，获得了普遍认可［8-9］。本研究采用紫外-可见分光光度法测定八爪金龙中总皂苷的含量，该法具有良好的精密度、重复性和准确度，为下一步开发八爪金龙的制剂工艺与药理学研究奠定了基础。

［1］李金玲，赵致，刘红昌，等.贵州特色苗药八爪金龙立地环境调查研究［A］.//第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集［C］.2011:250.

［2］项楠.八爪金龙为主治疗慢性咽炎的临床疗效观察——附133例病例报告［J］.成都中医药大学学报，1996，19(4):23-24，28.

［3］蔡佳仲，胡英杰.百两金皂苷类似物的化学与药理学研究进展［J］.天然产物研究与开发，2012，24(11):1671-1679.

［4］拓小瑞，王剑波.紫金牛属植物皂苷类化学成分及其抗肿瘤作用研究进展［J］.西北药学杂志，2012，27(4):390-394.

［5］任亚硕，吴德玲，张伟，等.紫外分光光度法测定醉鱼草果实中总三萜含量［J］.安徽中医学院学报，2012，31(5):78-80.

［6］徐东升，高言明，杨春，等.钩藤总黄酮含量测定研究［J］.微量元素与健康研究，2015，32(1):29-30.

［7］彭敏桦，张敏敏，沈雅婕，等.岗梅总皂苷含量测定方法建立及不同部位含量比较研究［J］.中国医药导报，2015，21(3):29-30，34.

［8］王雷，杨新建，寇欣.紫外分光光度法在中药分析中的应用进展［J］.天津药学，2003，15(5):62-64.

［9］李兰英，郑国金.紫外-可见分光光度法在药物分析中的应用［J］.中国医药指南，2013，11(30):295-297.