高效液相色谱法同时测定通脉冲剂中葛根素、阿魏酸和丹酚酸B的含量

徐海燕，孔令提(1.重庆市南川区人民医院药剂科，重庆 408400;2.蚌埠医学院第一附属医院药剂科，安徽蚌埠 233000)

通脉冲剂是由丹参、川芎和葛根等3味中药按1∶1∶1(W∶W∶W)的比例加工制成的复方制剂，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂(第四册)》(标准编号:WS3-B-0824-91)，具有活血化瘀等功效，用于缺血性心脑血管疾病、动脉硬化、脑血栓、脑缺血、冠心病、心绞痛等［1］。通脉冲剂中的丹酚酸B、阿魏酸和葛根素为主要药理活性成分，具有保护脑缺血再灌注损伤、改善血液流变学指标和抗动脉粥样硬化等作用［2-4］。因此，测定上述三者的含量可作为评价该制剂质量的客观指标之一。原标准中无含量测定项，为有效控制本品质量、保证临床疗效，本研究建立了同时测定通脉冲剂中葛根素、阿魏酸和丹酚酸B含量的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)。

1 材料

1.1 仪器

岛津LC-2010A型HPLC仪(日本SHIMADZU公司)，KQ-250E型医用超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)，AB135-S型十万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

通脉冲剂(自制，批号:20130609、20130616、20130706);葛根素、阿魏酸和丹酚酸B对照品(中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号分别为110752-200511、110773-9910和111562-201110);甲醇、甲酸均为色谱纯;水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:岛津 ODS-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇-0.1%甲酸(V∶V=30∶70);流速:1.0 ml/min;柱温:35℃;检测波长:321 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备:分别精密称取对照品葛根素10.05 mg、阿魏酸 5.25 mg、丹酚酸 B 9.95 mg，分别置于10 ml容量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，即得葛根素、阿魏酸和丹酚酸 B质量浓度分别为 1.0050、0.5250、0.9950 mg/ml的对照品储备溶液。分别精密量取葛根素2.0 ml、阿魏酸0.1 ml、丹酚酸 B 2.0 ml，置于同一 5 ml容量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，即得每1.0 ml含葛根素402.00 μg、阿魏酸 10.50 μg、丹酚酸 B 398.00 μg 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备:取本品0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 ml，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备:按处方比例，按制备工艺分别配制缺丹参、川芎和葛根的阴性制剂，再按“2.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各20 μl，注入 HPLC仪测定，按“2.1”项下色谱条件进行测定。色谱图见图1，葛根素、阿魏酸和丹酚酸B与相邻色谱峰的分离度均＞1.5，理论板数应均不低于5000。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液，分别精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，置于 1 ml容量瓶中，加 50% 甲醇溶液稀释至刻度，制成系列质量浓度的混合对照品溶液。分别吸取20 μl注入HPLC仪测定，以对照品质量浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归处理，得葛根素、阿魏酸和丹酚酸B的回归方程分别为:Y=20.461X－174.62(r=0.9999，n=6)、Y=201.58X －6.759(r=0.9999，n=6)和 Y=23.162X－131.15(r=0.9999，n=6)。结果表明，葛根素、阿魏酸和丹酚酸B的质量浓度在40.20～402.00、1.05～10.50、39.80～398.00 μg/ml内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取葛根素、阿魏酸和丹酚酸B质量浓度分别为160.80、4.20 和 159.20 μg/ml的混合 对 照 品 溶液20 μl，连续进样5次，测得葛根素、阿魏酸和丹酚酸 B的RSD分别为0.96%、1.82%和1.58%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下的供试品溶液(批号:20130609)适量，分别于放置0、4、8、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示，葛根素、阿魏酸和丹酚酸B的RSD分别为1.61%、1.38%和1.46%，表明供试样品在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取通脉冲剂(批号:20130609)0.5 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示，葛根素、阿魏酸和丹酚酸B的平均质量浓度分别为 12.14、0.52和 16.58 mg/g，RSD分别为 1.04%、1.87%和1.15%，表明本方法的重复性良好。

2.8 加样回收试验

分别精密称取对照品葛根素、阿魏酸和丹酚酸B适量，置于同一25 ml容量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，制得每1 ml含羟基红花黄色素A 1.02 mg、阿魏酸0.04 mg、丹酚酸B 1.40 mg的混合对照品溶液。分别称取已知含量的通脉冲剂(批号:20130609)0.25 g，共9份，精密称定，每3份为一组，分别精密加入混合对照品溶液 0.8、1.0、1.2 ml，同“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

按上述含量测定方法，对3批样品进行测定，结果见表2。

3 讨论

参照《中华人民共和国药典》［5］及全波长扫描结果，葛根素、阿魏酸、丹酚酸B的最大吸收波长分别为250、321、286 nm，但为节省样品分析时间及考虑到阿魏酸在制剂中的含量最低，本研究选择在321 nm波长处同时对葛根素、阿魏酸、丹酚酸B进行测定，后续试验证实可满足检测需要。

在流动相的选择方面，葛根素、阿魏酸、丹酚酸B均为酸性化合物，在流动相中加入少量甲酸可减少拖尾及改善分离度［6-8］。本研究先后对乙腈-甲酸系统和甲醇-甲酸系统的比例及酸浓度进行优选，根据分离度结果，最终选定甲醇-0.1%甲酸(V∶V=30∶70)为流动相。方法学考察及3批制剂的含量测定表明，本方法简便可行、重复性好，能有效控制该制剂的质量，从而确保临床疗效。

表1 加样回收率试验结果(n=9)Tab 1 Results of recovery tests(n=9)

表2 样品含量测定结果(n=3)Tab 2 Results of content determination of samples(n=3)

［1］卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂(第四册)［S］.北京:卫生部，1997:169-170.

［2］赵莹莲.葛根素的药理作用及临床应用进展［J］.安徽医药，2010，14(12):1377-1379.

［3］马丙祥，董宠凯.丹参的药理作用研究新进展［J］.中国药房，2014，25(7):663-665.

［4］舒冰，周重建，马迎辉，等.中药川芎中有效成分的药理作用研究进展［J］.中国药理学通报，2006，22(9):1043-1047.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:38，71，313.

［6］赵振霞，刘永利，王敏，等.HPLC、UPLC法同时测定心可舒胶囊中4种成分的含量［J］.中国药科大学学报，2014，45(5):563-566.

［7］曹云飞，叶飞，陈娜.HPLC法测定鼻窦炎口服液中阿魏酸的含量［J］.药学研究，2014，33(12):691-692.

［8］林徐剑，沈莹，施晓萍.丹参原药材和饮片与不同温度的水接触后丹酚酸B的含量变化［J］.中国药学杂志，2014，49(17):1506-1507.