冠状动脉结扎（孙络疏失）模型大鼠心肌组织梗死区及缺血区ICAM-1、VCAM-1基因表达的研究*

霍 旺 张俊修 李绍旦 杨明会 刘 毅

（中国人民解放军总医院中医院，北京 100853）

冠状动脉结扎（孙络疏失）模型大鼠心肌组织梗死区及缺血区ICAM-1、VCAM-1基因表达的研究*

霍 旺 张俊修 李绍旦 杨明会△刘 毅

（中国人民解放军总医院中医院，北京 100853）

目的 探讨“孙络疏失”模型大鼠心肌组织梗死区及缺血区细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）基因表达变化规律。方法 选取心电图正常雄性SD大鼠60只，并随机分为假手术组、造模30min组、造模1 h组、造模6 h组、造模12 h组和造模24 h组，共6组，每组10只。通过结扎冠状动脉左前降支建立“孙络疏失”模型，假手术组只穿线不结扎。各组大鼠按分组时间点于梗死区及缺血区各取部分心肌组织，利用Real-Time PCR方法检测“孙络疏失”模型大鼠不同时间点梗死区及缺血区ICAM-1、VCAM-1基因表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠梗死区中ICAM-1 mRNA表达自结扎后12 h开始显著升高并持续至结扎后24 h（P＜0.01）；而在缺血区中ICAM-1 mRNA表达在结扎后6 h开始显著升高并持续至结扎后24 h（P＜0.01）。VCAM-1 mRNA表达方面，梗死区中VCAM-1 mRNA表达在结扎后24 h显著升高（P＜0.01）；而在缺血区内VCAM-1 mRNA表达在结扎后1 h即可显著升高并持续至结扎后24 h（P＜0.01）。结论“孙络疏失”早期即可出现炎症因子异常表达，且缺血区内炎症因子的过度表达要早于同时段的梗死区域。

孙络疏失 心肌缺血 ICAM-1 VCAM-1 大鼠

中医学认为“孙络”即为经络网络系统中最末端最细小的层次，是人体运行气血的最小功能单位［1］。吴以岭院士提出“脉络-血管系统病”理论，并认为“孙络”与现代医学之微循环具有同一性［2］。因此，微血管病变导致器官组织功能、结构的病理改变与“孙络”受损进而导致孙络病的病理变化具有密切相关性。冠状动脉微循环障碍是急性心肌梗死经皮冠状动脉介入治疗过程中常见的并发症，是影响冠状动脉微循环灌注的主要原因，是决定急性心梗患者远期预后不良和死亡率的独立危险因素［3］。但目前现代医学针对冠脉微循环障碍的治疗缺乏系统、规范、特效的方法。本课题组在既往研究基础上提出营卫承制调平理论，并反映了血管病变作为复杂性疾病在生理、病理、治疗以及转归等不同阶段的内在规律［4］，以期发挥中医药整体调节以及多层面、多靶点的优势，在冠脉微循环障碍性疾病中做出一定的突破。本研究以脉络学说为指导思想，以结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法建立 “孙络疏失”模型，并探讨“孙络疏失”病理状态下血管内皮细胞炎性因子动态变化规律，为脉络学说认识、治疗冠状动脉微循环障碍提供一定的数据支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（220± 20）g，购自军事医学科学院动物中心，动物许可证号：SCXK-（军）2012-0004。按每笼5只饲养于独立通气笼具系统内，温度（22±1）℃，湿度（50±5）%，每天光照与黑夜时间各12 h。实验期间造模、取材等操作均在超净工作台内进行，添加饲料、换水等由专人负责管理。

1.2 主要试剂 乌拉坦 （国药集团化学试剂有限公司，批号T2011110）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号：F3047216）；RNA pure超纯总RNA快速提取试剂盒 （博迈德生物技术有限公司，批号：67691288）；Trans Script First-strand cDNA Synthesis Super Mix（北京全式金生物技术有限公司，批号：I10725）；Trans StartGreen qPCR Super Mix（北京全式金生物技术有限公司，批号：I10830）。

1.3 主要仪器 电子秤（长沙湘平科技发展有限公司，EPS-2001）；小动物心电图机（北京福田电子医疗仪器有限公司，FX-211）；动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司，ALC-V9）；超净工作台（北京长城空气净化工程公司）；高速离心机 （Perkin Elmer VICTOR X5）；Step One Plus Real-Time PCR System（Applied Biosystems）；Multiskan MK3酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模及分组 选取心电图正常大鼠60只，按照随机数字表法分成假手术组、造模30min组、造模1 h组、造模6 h组、造模12 h组和造模24 h组，共6组，每组10只。“孙络疏失”大鼠模型参照文献［5］，大鼠以20%乌拉坦按5mL/kg腹腔注射麻醉后，经口气管插管连接呼吸机，设定呼吸频率80次/min、潮气量15mL/kg、呼吸比1∶1。于大鼠左侧胸壁3～4肋间横向开胸，暴露心脏，撕开心包膜，在冠状动脉左侧主干处，左心耳下方约2～3mm处以左心耳与肺动脉圆锥间左冠状静脉主干为标志结扎（假手术组只穿线，不接扎），进针深度约1～1.5mm，宽约2.0mm，逐层关闭胸腔，待大鼠自主呼吸恢复后，移除呼吸机。以室壁运动减弱，结扎下部心肌组织颜色变白，心电图可见胸前各个导联的ST段抬高、T波高耸为造模成功标志，造模后每只大鼠一次性注射青霉素钠40万U预防感染。

1.5 梗死区及缺血区细胞间黏附分子-1（ICAM-1）mRNA、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）mRNA表达各组大鼠到达分组时间点后，取左心室前壁梗死区及缺血区心肌组织约100mg置于液氮中，-80℃冰箱保存待测。利用总RNA快速提取试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计测定纯度并定量。逆转录合成cDNA，PCR反应体系及反应条件均参照说明书设定。采用2-ΔΔct方法计算相对定量mRNA。引物由Invitrogen公司根据GenBank所发布的序列设计并合成，引物序列参见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。所有数据均以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

由表2，3可知，与假手术组比较，模型组大鼠梗死区中ICAM-1mRNA表达自结扎后12 h开始显著升高并持续至结扎后24 h（P＜0.01）；而在梗死区中，VCAM-1mRNA表达在结扎后24 h显著升高（P＜0.01），其余各组表达并无明显变化。而与假手术组比较，模型组大鼠缺血区ICAM-1mRNA表达在结扎后6 h开始显著升高并持续至结扎后24 h（P＜0.01）。与之类似，模型组大鼠缺血区VCAM-1mRNA表达在结扎后1 h即可显著升高并持续至结扎后24 h（P＜0.01）。

表2 各组大鼠梗死区ICAM-1、VCAM-1mRNA表达（±s）

表2 各组大鼠梗死区ICAM-1、VCAM-1mRNA表达（±s）

与假手术组比较，*P＜0.01。下同。

组 别 n ICAM-1mRNA VCAM-1mRNA假手术组 10 1.01±0.18 1.00±0.10造模30min组 10 0.79±0.53 1.49±0.32造模1 h组 10 1.76±0.94 1.46±0.24造模6 h组 10 1.99±1.05 1.18±0.16造模12 h组 10 4.01±2.26* 1.39±0.2造模24 h组 10 5.40±2.88* 4.54±0.46*

表3 各组大鼠缺血区ICAM-1、VCAM-1mRNA表达（±s）

表3 各组大鼠缺血区ICAM-1、VCAM-1mRNA表达（±s）

组 别 n ICAM-1mRNA VCAM-1mRNA假手术组 10 1.00±0.12 1.01±0.11造模30min组 10 2.09±0.39 1.30±0.10造模1 h组 10 1.10±0.21 2.51±0.68*造模6 h组 10 6.39±2.04* 4.75±0.50*造模12 h组 10 6.90±1.80* 4.55±0.68*造模24 h组 10 5.91±1.94* 5.04±0.80*

3 讨 论

3.1 关于孙络疏失模型 “孙络疏失”是在络病学理论基础上提出的新概念。“脉络-血管系统病”理论认为，脉络与中小血管以及微循环具有密切相关性，孙络作为脉络分支的最末端结构与微循环相对应，二者在结构分布、生理功能、病理变化等方面均具有同一性［6-7］。因此，“孙络疏失”的病变基础在微循环，“疏”指数量的减少，“失”是“疏”的进一步发展，造成了小范围内的“孙络”消失，同时“疏失”也指功能的缺失［8］。结扎大鼠冠状动脉左前降支建立的急性心肌缺血模型，已被广泛证实其微血管密度显著降低［9］，与“孙络疏失”之结构概念变化相对应；而心肌梗死后左心功能的病理改变也与“孙络疏失”后营卫气化功能失司而致“孙络”渗灌气血濡养脏腑的功能受损表现相一致［10］。因此，可以选择通过结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法来建立心之络病“孙络疏失”的病理模型。

3.2 “孙络疏失”模型血管内皮细胞炎性因子动态变化 ICAM-1、VCAM-1是由血管内皮细胞等多种细胞产生的一类黏附分子，属于免疫球蛋白超家族成员。二者分别通过与白细胞表面相应的配体CD11/CD18复合物以及VLA-4结合的方式，促进白细胞的滚动黏附和炎性渗出，在介导炎症细胞浸润及血栓形成过程中发挥着重要作用。有研究表明，心肌缺血后细胞黏附分子表达明显升高［11］，促进了炎症反应进程，进一步加重缺血引起的损伤，最终导致血管内皮结构和功能的破坏。因此，细胞黏附分子水平能够反映血管内皮细胞的损伤及炎症反应的程度［12-13］。

本研究结果表明，梗死区ICAM-1mRNA的表达在结扎冠状动脉左前降支造成“孙络疏失”后12 h开始显著升高，并持续至结扎24 h。梗死区中VCAM-1 mRNA表达在结扎后24 h开始显著升高。而在模型组大鼠缺血区中ICAM-1mRNA表达在结扎后6 h开始显著升高并持续至结扎后24 h。与之类似，模型组大鼠缺血区内VCAM-1mRNA表达在结扎后1 h即可显著升高并持续至结扎后24 h，均早于二者在梗死区内的表达。此结果提示，“孙络疏失”早期即可出现炎症细胞浸润并最终导致血管内皮细胞损伤，并且缺血区域内的炎症变化进程要早于同时段的梗死区域。“孙络”即微血管仅有一层血管内皮细胞构成，微血管内皮细胞结构功能的完整对于微循环正常生理功能的发挥起到至关重要的作用。此次研究表明，由ICAM-1以及VCAM-1介导的炎症反应作为关键因素参与了“孙络疏失”病理变化过程，引起微血管内皮细胞的损伤，最终导致微循环障碍，这对于了解“孙络疏失”的病理变化过程，以及应用络病理论保护微血管内皮细胞，抑制炎症反应，改善微循环等方面均具有重要意义。

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Study of Gene Expression of ICAM-1 and VCAM-1 in Myocardium Infarct Area and Ischemic Area of Model Rats with the Pattern of Loosened and Weakened Minute Collaterals in the Domain of TCM by Coronary Artery Ligation

HUO Wang，ZHANG Junxiu，LI Shaodan，et al. Traditional Chinese Medicine Hospital，People′s Liberation Army General Hospital，Beijing 100853，China

Objective：To explore the change law of intercellular cell adhesion molecule-1（ICAM-1）and vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）in model rats with the pattern of loosened and weakened minute collaterals in the domain of Chinese medicine by coronary artery ligation.Methods：A total of 60 male Sprague-Dawley rats with regular ECG performance were randomized divided into the sham-operation group，the 30 min-modeling group，the 1 h-modeling group，the 6 h-modeling group，the 12 h-modeling group and the 24 h-modeling group.The model of loosened and weakened minute collaterals in heart was established by ligation of the left anterior descending coronary artery，while the sham group was punctured without ligation.The gene expression of ICAM-1 and VCAM-1 in different areas and time points were detected by Real-time qPCR method.Results：Compared with the sham group，the gene expression of ICAM-1 in the infarct zone was significantly increased after ligation from 12 h to 24 h（P＜0.01）.And in the ischemic area，it was significantly increased after ligation 6 h and continued to ligation 24 h（P＜0.01）.And the VCAM-1mRNA expression in the infarct zonewas significantly increased after ligation 24 h（P＜0.01），whereas it was significantly increased in the ischemic area after ligation 1h and continued to ligation 24 h （P＜0.01）.Conclusion：The infiltration of inflammatory cell can occur in the acute phase of loosened and weakened minute collaterals and eventually lead to the damage of endothelial cell. Meanwhile，the inflammatory changes occur earlier in ischemic area than the infarct region.

Decrease of minute collaterals；Myocardial ischemia；ICAM-1；VCAM-1；Rat

R285.5

A

1004-745X（2015）05-0757-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.002

2015-03-02）

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2012B518601C）

△通信作者（电子邮箱：ymh9651@sina.com）