奶母果对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-性腺轴中钙调蛋白mRNA表达量的影响

余世荣

（湖北医药学院附属人民医院药学部，湖北十堰442000）

奶母果对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-性腺轴中钙调蛋白mRNA表达量的影响

余世荣

（湖北医药学院附属人民医院药学部，湖北十堰442000）

目的研究奶母果对肾阳虚大鼠模型下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴钙调蛋白（CaM）mRNA表达量的影响。方法应用外源性糖皮质激素（氢化可的松）制作肾阳虚大鼠模型，检测各组大鼠HPG轴中CaM mRNA表达量，分析奶母果对HPG轴中下丘脑、睾丸CaM mRNA的影响。结果高剂量的奶母果瘿果可提高肾阳虚大鼠HPG轴下丘脑CaM mRNA的表达量，降低睾丸CaM mRNA的表达量，而奶母果瘿果低剂量组和花序托组作用不明显。结论奶母果可通过提高肾阳虚大鼠下丘脑CaM mRNA的表达改善其肾阳虚症状。

奶母果；钙调蛋白；下丘脑-垂体-性腺轴；钙调蛋白mRNA

奶母果又名薜荔果，为桑科榕属植物薜荔Ficus pumila Linn.Var.pumila干燥成熟的雄性隐花果，有补肾固精、催乳、散毒之功效，主治肾虚遗精、小便淋浊、阳痿、闭经、疝气、乳汁不下、久痢痈肿等证［1-2］。奶母果由瘿果、雄花和花序托组成，瘿果内含不同发育阶段的薜荔榕小蜂，但各文献对奶母果药用部位的记载不尽相同［3-4］。柯尊琼等［5］的研究表明，奶母果能改善肾阳虚大鼠体征，降低血清雌二醇（E2）水平，提高睾酮（T）水平使之恢复接近正常值，延长肾阳虚大鼠负重游泳时间，并可纠正肾阳虚大鼠睾丸的病理性肿大和体重下降趋势，与花序托相比，其补肾作用优于后者。奶母果水提物还可提高免疫低下小鼠的胸腺指数和脾脏指数，增强免疫低下小鼠的免疫功能［6］。本研究中采用氢化可的松肌肉注射复制肾阳虚大鼠模型［7］，观察奶母果中瘿果和花序托对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的调节作用，以期从分子水平阐述奶母果补肾作用机制及瘿果和花序托药理作用的差异。

1 材料与方法

1.1仪器、试药与动物

仪器设备：PCR仪（Biometra，德国）；高速冷冻离心机（Hettich Universal，德国）；超低温冰箱（-80℃，Sanyo，日本）；紫外凝胶图像分析仪（上海天呈科技有限公司）；台式高速冷冻离心机（Hettich，德国）。

药品与试剂：注射用氢化可的松琥珀酸钠（天津生物化学制药有限公司，批号为20080509）；灭菌注射用水（漯河市方汇药业有限公司）；淫羊藿、奶母果（十堰市中药材公司，批号分别为091001，090901）均经湖北医药学院药学院张晓燕副教授鉴定为正品。TRIZOL试剂盒（Invitrogen，美国）；逆转录和扩增试剂盒（Fermentas Life Science，加拿大）；引物合成、DNA marker（北京赛百盛生物科技有限公司）；琼脂糖（Biowest公司，上海Yito公司分装）；溴化乙锭（EB，上海生工生物技术有限公司）；其他试剂均为分析纯。

试验动物：SPF级SD雄性大鼠70只，体重（220±30）g，由湖北医药学院实验动物中心提供，许可证号为［SCXK（鄂）2005-0008］；动物在屏障系统环境下用专用的饲料和灭菌水分笼饲养，试验动物使用许可证号为［SYXK（鄂）2004-0021］。

1.2 方法

1.2.1 药品配制

分别取一定量的花序托、瘿果和淫羊藿加适量的水浸泡，煎煮3遍，每遍1 h，煎液合并，各浓缩成每1 mL相当于1 g原药材的浓缩液，分装成每袋20 mL，临用时配制成需要的质量浓度；注射用氢化可的松琥珀酸钠临用时配制成25 g/L。

1.2.2 造模、分组与给药

SPF级SD大鼠70只，适应性喂养7 d后，随机分为阳性药物（淫羊藿）对照组（ESM组）、正常组（N组）、肾阳虚模型组（DM组）、花序托低剂量组（RMSFP-L组）、花序托高剂量组（RMSFP-H组）、瘿果低剂量组（SGMSFP-L组）、瘿果高剂量组（SGMSFP-H组），每组10只，各组给药体积均为10 mL/kg。除正常组外，其他各组大鼠每日肌肉注射氢化可的松25 mg/kg，连续15 d，正常组大鼠肌肉注射等体积的0.9%氯化钠注射液。大剂量外源性糖皮质激素（如氢化可的松）可使垂体前叶促肾上腺皮质激素（ACTH）释放受抑，进而使肾上腺皮质分泌类固醇激素减少，促进大鼠蛋白质、脂肪分解，降低糖利用及抑制免疫作用，而出现“耗竭”现象，表现为体重减轻、活动减少、反应迟顿、肢尾冷、蜷曲拱背、松毛等畏寒肢冷的阳虚现象甚至死亡。制作模型的同时灌胃给药，正常组和模型组同时灌服蒸馏水2 mL/d；瘿果组、花序托组的低、高剂量组分别灌服12.0，24.0 g/（kg·d）浓缩液和阳性药物组灌服12.0 g/（kg·d）淫羊藿浓缩液。大鼠造模后第15天，脱臼处死，取出下丘脑、睾丸，以滤纸吸去表面残血，迅速于-70℃低温保存。

1.2.3 RT-PCR法检测钙调蛋白（CaM）的表达

引物设计：从Gene Bank中查出大鼠CaM基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的序列，设计引物。CaM的上游引物为5'-GGCATCCTGCTTTAGCCTGAG-3'（length21），下游引物为5'-ACATGCTATCCCTCTCGTGTGAC-3'（length23），扩增片段为328 bp。大鼠GAPDH上游引物［3］为5'-CCAAAAGGGTCATCATCTCC-3'，下游引物为5'-GTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3'，扩增片段为623 bp。

DNA提取：-70℃冻存的大鼠下丘脑、睾丸组织标本各取5个，精密称取（50±5）mg，分别置5 mL eppendorf（EP）管内，加入TRIZOL 1 mL，剪碎，充分匀浆，收集入1.5 mL EP管，冰上放置5 min，再加氯仿，混合均匀，于12 000 r/min离心15 min，吸取上清液于另一1.5mLEP管，加入异丙醇冰上放置30min，于14000r/min离心10min后弃上清液，再向管中加入75%乙醇洗涤，于14000 r/min离心5 min，弃上清液，将EP管倒置在滤纸上自然挥发乙醇，管底RNA用焦碳酸二乙酯水（DEPC）溶解。取RNA溶液2 μL，加DEPC水198 μL，以DEPC水为空白管，紫外分光光度计测定总RNA纯度（A260/A280为1.5～2.0）。结果RNA纯度为1.7，符合要求。

逆转录：取处理好的200 μL EP管，每管平均加入一定量DEPC和Oligo dT 1 μL，再加入一定体积的RNA，混匀，低速离心轻甩，上机65℃5 min，取出置冰上每管加入（5×buffer 4 μL、10 mm dNTP 2 μL、RNase 1 μL、M-MuLV RT 1 μL），震荡混匀，低速离心轻甩，上机逆转录（42℃1 h，70℃10 min）。反应完成后取出冰浴，于-20℃保存。

聚合酶链反应（PCR）扩增反应体系：取处理好的200 μL EP管，每管分别加入DEPC水90 μL，cDNA 10 μL稀释混匀。取扩增体系（2×Mix 10 μL、上下游引物各2 μL），分别加入相应cDNA稀释液6 μL，低速离心轻甩。设定反应条件为，预变性94℃5 min；变性94℃40 s；退火58℃40 s；延伸72℃40 s，26个循环；最终延伸72℃10 min；储存4℃10 min。反应完成后取出后冰浴，于-20℃保存。

琼脂糖凝胶电泳：取1.5%的琼脂糖加入装有硼酸（TBE）缓冲液的烧瓶中煮沸，溶解，冷却到50～60℃加入1‰的EB混匀后，缓慢倒入放在4℃的冰箱中的胶槽中30 min，取出。放入电泳槽，胶孔放在靠阴极侧，倒入TBE缓冲液浸没凝胶。取出储存的PCR产物，每管加4 μL 6×loading Buffer，混匀，取15～20 μL进行点样，预留1号孔加10 μL Marker作为对照；在60～70 V恒定电压下电泳分离PCR产物。

CaM表达量的测定：各组CaM和GADPH mRNA在条带应有显示。将下丘脑和睾丸的电泳条带图应用凝胶成像系统拍摄，以内参GADPH条带确定CaM的精确区域［8］。采用生物医学影像分析软件ImageJ 1.43测量电泳的灰度，计算相对含量（相对含量= CaM条带灰度/内参条带灰度）。

1.3 统计学处理

2 结果

各组相对于Marker在328 bp（CaM mRNA），623 bp（GADPH mRNA）均有条带。电泳图表明，所扩增片段睾丸CaM mRNA（328 bp），GADPH mRNA（623 bp）为特异性扩增（见图1），下丘脑CaM mRNA（328 bp），GADPH mRNA（623 bp）为特异性扩增（见图2）。CaM mRNA相对含量见表1。可见，SGMSFP-H组能极显著提高肾阳虚大鼠下丘脑的CaM mRNA表达量（P＜0.01），而SGMSFP-L组无明显差异。

图1 各组睾丸CaM mRNA和GAPDH mRNA表达的电泳图

图2 各组下丘脑CaM mRNA和GAPDH mRNA表达的电泳图

表1 各组睾丸、下丘脑的CaM mRNA相对含量比较

3 讨论

临床肾阳虚患者肾上腺皮质功能低下，需长期使用大剂量外源性皮质激素，同时长期大量肾上腺皮质激素治疗可致下丘脑-垂体-肾上腺反馈抑制，当皮质激素突然停用，HPG轴的抑制状态即暴露出来，表现不同程度的HPG轴功能低下［9］，出现肾阳虚证。试验以此为依据复制了肾阳虚大鼠模型。

CaM是一种多功能的Ca受体蛋白，通过与Ca2+结合形成复合物而介导许多功能蛋白和结构蛋白的相互作用，从而参与各种细胞功能调控，引起一系列生理生化反应，在细胞信号转导中起非常重要的作用［10］。Iwamoto等［11］的研究表明，CaM除调节细胞周期和启动DNA合成外，还能通过调节蛋白质的磷酸化和脱磷酸化来刺激某些细胞合成RNA；并且分别激活腺苷环化酶和磷酸二酯酶影响cAMP来调节细胞分化增殖，从而影响cAMP代谢。有研究已证明，可通过测量CaM在HPG轴中的表达量来观察HPG轴的功能［12］。

本研究结果显示，模型组大鼠睾丸组织中CaM的相对表达明显高于正常组，而下丘脑中CaM mRNA的表达则无明显改变。这提示睾丸中的Ca过度表达与肾阳虚证密切相关。性器官功能低下是肾阳虚的主证之一，CaM在性腺的过度表达，也是性器官功能损伤的表现之一［12］，本研究结果与之相符。同时，本研究结果提示，CaM在睾丸中的表达，瘿果低、高剂量组与模型组都有显著性差异，但与淫羊藿组和正常组无显著性差异，进一步表明奶母果的补肾药用部位瘿果优于花序托。

综上所述，奶母果可通过降低肾阳虚大鼠睾丸CaM mRNA的表达量，提高下丘脑CaM mRNA的表达量而改善其肾阳虚症状，提高肾阳虚大鼠的存活率和生命质量，对阴损及阳的肾阳虚证，有较显著的补益肾阳功效。但其作用机制仍需进一步研究证实。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志第二十三卷第一分册［M］.北京：科学出版社，1998：205.

［2］湖北省食品药品监督管理局.湖北省中药材质量标准（2009版）［M］.武汉：湖北科学技术出版社，2009：46-47.

［3］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编［M］.北京：人民卫生出版社，1996：923.

［4］湖北省卫生厅.湖北省中药炮制规范［M］.武汉：湖北科学技术出版社，1989：125.

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［11］Iwamoto N，Lu R，Tanaka N，et al.Calmodulin interacts with ATP binding cassette tansporter A1 to proctect from calpain-Mediated degradation andupregulateshigh-densityLiporoteingeneration［J］.ArteriosclerThromb Vasc Biol，2010，13（5）：1 446-1 452.

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Influence of Ficus Pumila Linn.on Calmodulin mRNA Expression Level in Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis of Rats with Kidney-Yang Deficiency

Yu Shirong
（Department of Pharmacy，The Affiliated Renmin Hospital of Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China 442000）

ObjectiveTo study the influence of Ficus pumila Linn.（FPL）on calmodulin mRNA expression level in hypothalamic-pituitary-gonadal（HPG）axis of rats with kidney-yang deficiency.MethodsRats with kidney-yang deficiency were induced by exogenous glucocorticoids（Hydrocortisone）to analyze the influence of FPL on calmodulin mRNA expression level in hypothalamic-pituitarygonadal axis function by detecting calmodulin mRNA expression level in HPG axis.ResultsHigh dose of FPL had obvious regulating effect on calmodulin mRNA expression level in HPG axis of rats with kidney-yang deficiency.ConclusionFPL can tonify the kidney by regulating calmodulin mRNA expression level in HPG axis of rats with kidney-yang deficiency.

Ficus pumila Linn.；calmodulin；hypothalamic-pituitary-gonadal axis；calmodulin mRNA

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）20-0056-03

2015-01-27）