新型基因重组藻胆蛋白对小鼠S180实体瘤突变型P53表达的影响

张晓平，张文平，侯林，田景振

（1.山东中医药大学药学院，山东济南250355；2.云南中医学院药学院，云南昆明650500）

新型基因重组藻胆蛋白对小鼠S180实体瘤突变型P53表达的影响

张晓平1，张文平2，侯林1，田景振1

（1.山东中医药大学药学院，山东济南250355；2.云南中医学院药学院，云南昆明650500）

目的探讨新型基因重组藻胆蛋白对小鼠S180实体瘤突变型P53表达的影响。方法将小鼠腋下接种S180细胞荷瘤造模后，随机分为阴性组，环磷酰胺组，新型基因重组藻胆蛋白组［50 mg/（kg·d）］，天然藻蓝蛋白低、高浓度组［25，100 mg/（kg·d）］，共5组，阴性组给予等量生理盐水，静脉注射给药11 d后处死，剥离肿瘤，采用免疫组化方法检测肿瘤组织中突变型P53的表达。结果新型基因重组藻胆蛋白组，天然藻蓝蛋白低、高浓度组突变型P53平均阳性表达率分别为12.28%，18.76%，15.80%，均低于阴性组的60.08%（P＜0.05）。结论新型基因重组藻胆蛋白可明显抑制突变型P53表达（P＜0.05），可能对突变型P53表达有下调作用。

新型基因重组藻胆蛋白；突变型P53；表达

藻胆蛋白（phycobiliprotein）是主要来自真核藻类的一种捕光色素蛋白，在抗肿瘤、抗氧化等方面活性较高，有开发成为药物的极大潜力［1］，新型基因重组藻胆蛋白可解决药物开发过程中成本高、杂质多、周期长的问题。藻胆蛋白抗肿瘤功效已见大量报道［2-3］，但其抗肿瘤作用机制仍不明确。本研究中利用免疫组化方法研究新型藻胆蛋白与肿瘤密切相关的P53蛋白表达量的关系，并探讨藻胆蛋白抑制肿瘤生长的方式与途径，为开发新的海洋药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物、试药及仪器

动物及瘤株：清洁级昆明小鼠50只，体重18～23 g，雄性，由山东鲁抗医药股份有限公司质检中心实验动物室提供，动物合格证编号SCXK（鲁）20080002。小鼠S180实体瘤细胞，购于上海市细胞研究所，采用常规方法小鼠体内腹腔传代。

药品与试剂：新型基因重组藻胆蛋白（实验室自制）；藻蓝蛋白从螺旋藻中提取（食品级螺旋藻粉，购自江苏赐百年公司）；注射用环磷酰胺（CY，江苏恒瑞医药股份有限公司，规格为每瓶0.2 g）；苏木色精（上海蓝季科技发展有限公司）；30%过氧化氢（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；兔抗小鼠P53多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；SABC试剂盒（包括生物素化山羊抗兔IgG 5%即用型BSA SABC工作液，武汉博士德生物工程有限公司）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

仪器：KD-202轮转式切片机（浙江省金华市科技仪器设备有限公司）；生物图像分析系统（江苏捷达科技公司提供），OLYMPUS-BX50显微镜（日本OLYMPUS公司）；ZMN-7803型自动组织包埋机（常州华利电子公司）；Simple PCI图像分析系统（V5.2，CompixInc，美国）。

1.2 方法

肿瘤动物模型的建立［4］：将冻存的S180肉瘤细胞复苏活化，并传代4代。无菌抽取S180肉瘤小鼠腹腔积液，高压灭菌，稀释，以每只0.2 mL在小鼠腋下注射，24 h后随机分5组。阴性组给予生理盐水0.5 mL灌胃；新型基因重组藻胆蛋白组按50 mg/（kg·d）；天然藻蓝蛋白按25，100 mg/（kg·d）分为高、低浓度组灌胃给药，环磷酰胺组30 mg/（kg·d）腹腔注射，每日1次，连续给药11 d。末次给药24 h后，处死剥瘤。

免疫组化过程：将肿瘤放入固定液中保存，病理常规脱水，石蜡包埋，切片，切片滴加突变型P53多克隆抗体。将含肿瘤组织的的载玻片经脱蜡、复水后，用3%H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，柠檬酸盐微波15 min进行抗原修复，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，滴加正常BSA，置湿盒中37℃孵育20 min，甩净液体，滴加突变型P53抗体（稀释度为1∶150），4℃孵育过夜，滴加二抗生物素标记二抗工作液40～50 μL，37℃湿盒内孵育20 min，PBS清洗后滴加SABC工作液37℃湿盒中孵育20 min，加DAB充分显色，显色后苏木精中复染2 min，处理，中性树胶封片。

突变型P53表达的检测：选择5个高倍视野，每个分别计数约500个细胞，取阳性显色平均数并评分。若着色较深定为2分，着淡色定为1分，基本上不着色定为0分。着色细胞占计数细胞的百分率≥51%为3分，26%～50%为2分，6%～25%为1分，≤5%为0分［5］。每张切片染色细胞的百分率得分染色程度的乘积为其最终得分。P53阳性细胞以细胞核着棕黄色为判定标准。

光镜检查：免疫组化后切片镜检，观察各肿瘤细胞生长情况。

1.3 统计学处理

采用Simple PCI图像分析系统对免疫组化结果进行分析，SPSS 17.0软件进行数据处理，多组数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用F检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各用药组小鼠S180实体瘤组织中P53表达与阴性组相比明显减少（P＜0.05）；新型基因重组藻胆蛋白组与天然藻蓝蛋白组相比明显减少（P＜0.05），与环磷酰胺组相比差异不明显（P＞0.05），结果见表1。突变型P53免疫组化主要在细胞核着色，呈棕黄色，或较浅的黄色。在显微镜下观察可发现，阴性组细胞核在苏木精复染后有一定程度的不规则现象，环磷酰胺组细胞核不规则程度较轻，新型基因重组藻胆蛋白组和天然藻蓝蛋白组也有一定程度不规则性，结果见图1。

表1 新型基因重组藻胆蛋白对突变型P53表达的影响

图1 各组免疫组化P53显微镜下照片（×400）

3 讨论

P53蛋白是一种基因调节蛋白，当DNA受到损伤时其表达急剧增加，表达主要在细胞核。P53蛋白分为野生型和突变型，野生型半衰期较短，不易检测，可使DNA受损，细胞凋亡，调控细胞周期，促进细胞分化而抑制肿瘤；而突变型半衰期长，能引起细胞恶性增生和突变，使蛋白产物表达增加［6］，可用免疫组化方法检测。本试验中即用该法检测突变型P53的表达情况。

本试验结果显示，阴性组中突变型P53阳性表达率最高，符合预期，其他各组对于突变型P53的表达均有明显的下调作用（P＜0.05），新型基因重组藻胆蛋白组、天然藻蓝蛋白组均与阴性组有显著性差异。环磷酰胺组对肿瘤抑制作用最明显，其次是新型基因重组藻胆蛋白组，天然藻蓝蛋白纯度越高抑瘤效果越好。

新型重组藻胆蛋白能抑制肿瘤细胞增殖，其作用机制可能与突变型P53的表达下调，减少其大量表达所造成的细胞分裂失去节制而使癌变增加，同时减少P53突变所造成的细胞周期监测点失去控制，及Bax/Bcl-2，Fas/Apol，IGF-BP3等蛋白对凋亡作用的失控有关，从而起到抑制肿瘤生长的作用。

［1］王庭健，林凡，赵方庆，等.藻胆蛋白及其在医学中的应用［J］.植物生理学通讯，2006，42（2）：303-307.

［2］Manconia M，Pendás J，Ledón N，et al.Fadda Phycocyanin liposomes for topical anti-inflammatory activity：in-vitro in-vivo studies［J］.Journal of Pharmacy and Pharmacology，2009，61（4）：423-430.

［3］李冰，褚现明，高美华，等.钝顶螺旋藻藻蓝蛋白诱导Hela细胞凋亡的分子机制研究［J］.中国药理学通报，2009，25（8）：1 045-1 050.

［4］吴蕾，庞广昌，陈庆森.螺旋藻藻蓝蛋白的规模化提取和色谱纯化技术研究进展［J］.食品科学，2008，29（4）：461-463.

［5］陈智彬，宋永胜.Survivin、Caspase-3、突变型P53对膀胱移行细胞癌预后的意义［J］.实用医学杂志，2009，25（3）：348-350.

［6］陆爱平，李吉友.DNA损伤修复能力、P53蛋白及增殖细胞核抗原在大肠癌发生过程中的变化［J］.中国肿瘤临床，1997，2（12）：926-930.

Effect of New Recombinant Phycobiliprotein on Expression of P53 Mutant of Mice Treated with S180 Solid Tumor

Zhang Xiaoping1,Zhang Wenping2,Hou Lin1,Tian Jingzhen1
（1.Department of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong,China250355；2.Department of Pharmacy，Yunnan University of TCM,Kunming,Yunnan,China650500）

ObjectiveTo explore the effect of new recombinant phycobiliprotein on the expression of P53 in mutant of mice treated with S180 solid tumor.MethodsThe tumor-bearing mice which were inoculated with S180 solid tumor were randomly divided into 5 groups：model group,cyclophosphamide group,new recombinant phycobiliprotein group［50 mg/（kg·d）］,low,high dose of phycocyanin group［25,100 mg/（kg·d）］,the same amount of sodium chloride injection was given to model group.After the intragastric administration for 11 d,the mice were put to death and the solid tumor was removed from each group,and the expression of P53 mutant was detected by immunohistochemical SABC method.ResultsThe average positive expression rates of P53 mutant among new recombinant phycobiliprotein group,low,high dose of phycocyanin group were 12.28%，18.76%，15.80%respectively,which were much lower than 60.08%of the model group（P＜0.05）.ConclusionNew recombinant phycobiliprotein may decrease the expression of P53 mutant significantly,and may have down-regulatory effect on the expression of P53 mutant.

new recombinant phycobiliprotein；P53 mutant；expression

R285.5；R282.77

A

1006-4931（2015）20-0028-03

张晓平（1987-），女，博士研究生，主要从事新药开发与中药炮制原理研究工作，（电子信箱）xia_opingzhang@ 126.com；田景振，男，博士研究生导师，研究方向为新药开发与中药炮制原理研究，本文通讯作者，（电话）0531-89628597（电子信箱）tianjingzhen@163.com。

2014-11-13）