3种中药复方对药物所致肝内胆汁淤积大鼠胆汁的影响*

陈菲，方步武，吴咸中

（1.山东省聊城市人民医院药学部，山东聊城252000；2.天津医科大学药理学教研室，天津300070；3.天津市中西医结合急腹症研究所，天津300110）

3种中药复方对药物所致肝内胆汁淤积大鼠胆汁的影响*

陈菲1，2，方步武2，吴咸中3

（1.山东省聊城市人民医院药学部，山东聊城252000；2.天津医科大学药理学教研室，天津300070；3.天津市中西医结合急腹症研究所，天津300110）

目的观察柴郁汤、芍甘汤和痛泻要方在α-异硫氰酸萘酯（ANIT）造成的大鼠肝内胆汁淤积模型上的利胆作用。方法将健康Wistar大鼠96只分为12组，即正常对照组，胆汁淤积模型组（简称模型组），柴郁汤低、中、高剂量组，芍甘汤低、中、高剂量组，痛泻要方低、中、高剂量组和熊去氧胆酸组，各8只。第1天对大鼠进行胆管插管；第2天早上正常对照组灌胃食用豆油，其余组灌胃4%ANIT；第4天早上各组均收集1 h胆汁，然后除正常对照组灌胃蒸馏水外，其余各组灌胃相应药物，晚上再灌胃1次，灌胃1 h后收集1 h胆汁；第5天早晚各灌胃1次，晚上灌胃1 h后收集1 h胆汁。结果与给药前比较，3种中药复方给药后第2天胆汁均明显增多（P＜0.05）。结论柴郁汤、芍甘汤和痛泻要方对药物所致大鼠胆汁淤积皆有利胆作用。

α-异硫氰酸萘酯；柴郁汤；芍甘汤；痛泻要方；胆汁淤积

胆汁淤积是由于各种原因导致胆汁生成、分泌减少或排泄障碍所产生的临床综合征，可分为肝内性和肝外性。柴郁汤、芍甘汤和痛泻要方同属于理气开郁法的中药小复方，广泛应用于临床，但这些方剂的作用各有侧重。柴郁汤偏于疏肝活血，芍甘汤偏于柔肝解痉，而痛泻要方偏于疏肝理脾。无论是肝内胆汁淤积还是肝内阻塞性胆汁淤积，疏肝利胆治疗都是必需的。阻塞性胆汁淤积如胆道系统结石术后为防止结石复发，临床需配合利胆治疗；胆系感染在抗感染及去除梗阻的基础上，也多配合利胆治疗；即使是肝外梗阻，去除梗阻后配合利胆治疗也有利于去除残存的少量坏死脱落组织和防止感染。本研究中探讨了这些复方对病理性胆汁淤积的利胆作用。

1 材料与方法

1.1 动物与试药

健康Wistar大鼠96只，雌雄各半，体重230～250 g，军事医学科学院第四研究所提供，合格证号为准医动006。柴郁汤（2 g/mL）、芍甘汤（2 g/mL）、痛泻药方（1 g/mL）均由天津市中西医结合医院南开医院中药剂型改革研究室提供；熊去氧胆酸片（常州制药厂有限公司，批号为0412091）；α-异硫氰酸萘酯（ANIT，Sigma公司，批号为08420DD）。

1.2 方法

试验用药配制：3种中药复方详见表1。取ANIT粉末2 g，用食用豆油溶解，定容至50 mL，即配制成4%ANIT毒剂，现用现配，用时振荡摇匀。取30片熊去氧胆酸片（每片50 mg），用蒸馏水溶解定容至30 mL，振荡，使熊去氧胆酸均匀悬浮于蒸馏水中，即配制成50 g/L的熊去氧胆酸混悬液，用时振荡摇匀。

表1 3种中药复方的用药情况

动物分组及给药：将96只健康Wistar大鼠分为12组，即正常对照组（A组），胆汁淤积模型组（简称模型组，B组），柴郁汤低、中、高剂量组（C1，C2，C3组），芍甘汤低、中、高剂量组（D1，D2，D3组），痛泻要方低、中、高剂量组（E1，E2，E3组）和熊去氧胆酸组（F组），各8只。第1天对大鼠进行胆管插管；第2天早上A组灌胃食用豆油，其余组灌胃4%ANIT；第4天早上各组均收集1 h胆汁，然后除A组灌胃蒸馏水外，其余各组灌胃相应药物，晚上再灌胃1次，灌胃1 h后收集1 h胆汁；第5天早晚各灌胃1次，晚上灌胃1 h后收集1 h胆汁。给药容积为8 mL/kg。

大鼠肝内胆汁淤积模型制备：取大鼠，称重，禁食24 h。腹腔注射10%水合氯醛（每100 g体重0.3 mL）麻醉大鼠，仰卧位固定在手术台上，腹部备皮，75%乙醇消毒；剪开腹部正中的皮肤和肌肉，先找到胃，沿幽门部找到十二指肠，从肝门处找到开口于十二指肠乳头部的胆胰管；用镊子将覆盖在上面的被膜剥离，分离出靠近十二指肠乳头部的1.0～1.5 cm胆胰管；在剥离的胆胰管下穿过2根丝线，将靠近十二指肠乳头部的丝线结扎牢固，另1根待扎；提起已结扎的丝线，用镊子垫在已分离的胆胰管下面；用5 mL注射器的针头在分离的胆胰管远心端扎1个小口，把插管从小口处向肝门方向扎进0.5～1.0 cm，用待结扎的丝线结扎，可见浅黄色胆汁从胆胰管流出；在离胃幽门0.5～1.0 cm的十二指肠处用眼科剪作1个小切口，将插管插入约0.5 cm，并做荷包缝合；将2根插管的裸露端从皮下穿出，在背部正中偏下部用5 mL注射器的针尖连接起来，使胆汁在无需收集时能回流入十二指肠，模拟生理状态时胆汁的分泌情况。需要收集胆汁时将大鼠放入固定器中，将背部针尖连接处拔出，将胆汁引流入Eppendorf管中。

观察指标：观察造模后大鼠活动有无异常、胆汁回流是否通畅，收集各组大鼠给药前后共3个时间点的胆汁量。

1.3 统计学处理

2 结果

试验中，成功建立了肝内胆汁淤积模型并行清醒状态下大鼠胆汁收集。胆管插管成功后，在大鼠背部插管中可见浅黄色胆汁充盈，拔开背部插管接口的一端可见胆汁流出，说明胆汁回流通畅。造模后的大鼠进食少，活动少，小便发黄。3种中药复方对肝内胆汁淤积大鼠胆汁量的影响见表2。给药后第2天与给药前比较，各给药组胆汁均增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 模型的建立

目前造成胆汁淤积的动物模型有胆管结扎胆汁淤积模型［1］、内毒素诱发的胆汁淤积模型［2］、药物（如雌激素）诱发的胆汁淤积模型［3］，有的操作起来困难（如胆管结扎胆汁淤积模型，大鼠肝外胆管变异较多、极细、分支多少不一，有的可呈网状，完全结扎较难），有的模拟病因较局限（如雌激素诱发的胆汁淤积模型，主要模拟了口服避孕药引起的胆汁淤积以及妊娠肝内胆汁淤积的发生等）。本研究中采用了ANIT诱发的胆汁淤积模型。ANIT是一种间接肝毒剂，被广泛用于肝内胆汁模型的复制。ANIT可损害肝内胆管上皮细胞，引起毛细胆管增生及小叶间胆管周围产生炎症，从而造成胆管阻塞，形成明显的胆汁淤积；并伴随以点状坏死为主的肝实质细胞损害，出现胆汁分泌减少，血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBIL）水平均显著升高。其诱发大鼠肝损伤的生物化学和病理形态学改变与人类肝内胆汁淤积病变相似［4］。

3.2 胆汁的收集

以往观察药物的利胆作用都是收集麻醉状态下大鼠的胆汁［5-6］，不足之处主要有：因麻醉时间不宜过长，故胆汁收集的时间点不可能太多，收集时间也不能太长；麻醉状态下大鼠胆汁的分泌与生理状态下的分泌可能存在差异，且由于胆汁不能回流入十二指肠，使测定结果可能会与真实结果存在偏差。

本研究中采用收集清醒状态下大鼠胆汁的方法观察药物的利胆作用，收集的时间点较多（3个），收集时间长（2 d），可维持有效的胆汁肝肠循环，对胆酸池无影响，更接近生理状态下大鼠胆汁的分泌。但收集清醒状态下大鼠胆汁难度较大，一方面是胆管插管操作不易，插进胆胰管的插管过长易穿破胆胰管，过短易脱出胆胰管；另一方面是收集大鼠胆汁较难。本研究中共96只大鼠，有的大鼠在第2或第3个时间点时就将插管拔除。由于本研究中采用重复测量设计的方差分析统计数据，3个时间点的数据必须完整，故部分数据不能采用，导致最终只收集到74只大鼠的完整数据。

表2 3种中药复方对肝内胆汁淤积大鼠胆汁量的影响（±s，mL）

表2 3种中药复方对肝内胆汁淤积大鼠胆汁量的影响（±s，mL）

注：与A组比较，●P＜0.01；与B组同时间点比较，◆P＜0.05；与本组给药前比较，■P＜0.05，△P＜0.01；与本组给药后1 d比较，▲P＜0.01。

组别A组（n=6）B组（n=8）C1组（n=6）C2组（n=6）C3组（n=6）D1组（n=6）D2组（n=6）D3组（n=6）F1组（n=6）F2组（n=6）F3组（n=6）E组（n=6）给药前1.027±0.080 0.650±0.226 0.420±0.122●0.588±0.180●0.416±0.076●0.582±0.156●0.535±0.069●0.495±0.106●0.427±0.132●0.422±0.085●0.428±0.101●0.286±0.140●给药后1 d 1.175±0.137◆0.665±0.021 0.566±0.195 0.776±0.171 0.792±0.129◆0.657±0.107 0.712±0.106 0.710±0.089 0.585±0.199 0.650±0.114 0.560±0.170 0.432±0.140给药后2 d 1.170±0.314◆0.605±0.050 1.176±0.367△▲◆1.874±0.448△▲◆2.056±0.732△▲◆0.785±0.098◆1.147±0.135△▲◆1.448±0.379△▲◆0.943±0.295■1.406±0.465△▲◆1.206±0.242△▲◆1.618±0.696△▲◆

3.3 3种中药复方对胆汁量的影响

目前，对肝内胆汁淤积的治疗主要包括抗生素、肾上腺皮质激素、熊去氧胆酸［7］、苯巴比妥、S-腺苷蛋甲硫氨酸、消胆胺、血浆置换、基因治疗，但尚无特异性有效药物。中医药在肝内胆汁淤积的治疗方面有着悠久的历史，且能发挥积极和明显的作用。肝内胆汁淤积属中医“黄疸”范畴，主要病机是湿、热、瘀、毒，造成胆汁淤积于内，无法通降下行。历来对黄疸的中医药治疗方法多不胜数，有从内容上辨证论治处方用药或古方化裁变通方面等方法，形式上有单方、成方和验方等。其治疗法则主要有以下几种：清热利湿法，如《伤寒论》中的茵陈蒿汤；凉血解毒法，如《千金》中的犀角散；疏肝健脾法，如《景岳全书》中的柴胡疏肝散；活血化瘀法，有关研究证明了以赤芍、丹参为主药的处方有利胆功效［8-9］。

芍甘汤源于东汉张仲景《伤寒论·太阳篇》，是常用的缓急止痛之方，由芍药和甘草组方，治营阴不足、肝脾不和，症见脘腹诸痛，四肢挛急等。痛泻要方原名白术芍药散，乃《景岳全书》引刘草窗的一首方剂，亦是临床内科常用方剂，由白术、白芍、陈皮、防风组方，主治肝盛脾虚的泄泻（以腹痛肠鸣、大便泄泻、泻后痛减为主要特征）。柴郁汤由柴胡和郁金组方，柴胡能疏肝气，具有抗脂质过氧化作用，对保护肝细胞和恢复肝脏某些功能有一定作用［6］。郁金具有保肝作用，对大鼠中毒性肝炎有降酶、提高血浆总蛋白、促进白蛋白合成和抑制球蛋白生成作用，并具有抑制肝脏炎性反应和良好的抗损伤作用，能明显促进肝细胞修复，保护肝细胞，促进肝组织再生；还具有利胆作用，能使胆囊收缩，促进胆汁分泌，并可使尿中尿胆素减少。大剂量郁金与其他中药联用可显著降低血清胆红素水平［10］。

本研究结果表明，除模型组外，各组给药后胆汁量均较给药前有所增加，尤以给药后第2天明显，说明柴郁汤、芍甘汤和痛泻要方均有利胆作用。考虑其作用机制可能与修复损伤肝细胞，稳定肝细胞膜，从而使膜上的镶嵌蛋白如Na+，K+-ATP酶活性恢复，为胆汁的排泌提供能量有关。

［1］Lee J，Azzaroli F，Wang L，et al.Adaptive regulation of bile salt transporters in kidney and liver in obstructive cholestasis in the rat［J］.Gastroenterology，2001，121（6）：1 473-1 484.

［2］高宇，柴进，李绍雪，等.川西獐牙菜醇提物对内毒素所致大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用［J］.第三军医大学学报，2014，36（8）：769-773.

［3］Crocenzi FA，Mottino AD，Sanchez Pozzi EJ，et al.Impaired localisation and transport function of canalicular Bsep in taurolithocholate induced cholestasis in the rat［J］.Gut，2003，52（8）：1 170-1 177.

［4］Ding LL，Zhang BF，Dou W，et al.Protective effect of Danning tablet on acute livery injury with cholestasis induced by α-naphthylisothiocyanate in rats［J］.J Ethnopharmacol，2012，140（2）：222-229.

［5］朱平生，龙爱华，王兵.不同经典方剂对肝内胆汁淤积大鼠肝肾功能的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（5）：200-201.

［6］姚嘉明，于芳芳，王小奇，等.清热化湿疏肝祛瘀法对急性肝内胆汁淤积大鼠的防治作用［J］.中华中医药学刊，2012，30（10）：2 251-2 253.

［7］徐国光，巫善明，季媛媛，等.熊去氧胆酸联合S-腺苷蛋氨酸治疗药物性胆汁淤积型肝损伤［J］.肝脏，2014，19（5）：316-318.

［8］罗琳，吴锋，窦志华，等.芍药苷对胆汁淤积肝损伤保护作用机制研究［J］.南通大学学报：医学版，2011，31（6）：450-452.

［9］魏思思，赵艳玲，江凤娟，等.重用赤芍治疗ANIT诱导大鼠急性淤胆型肝炎的研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（12）：151-155.

［10］杨涤，孙凤霞，郜桂菊，等.淤胆汤治疗急性淤胆型肝炎疗效观察［J］.中国肝脏病杂志：电子版，2013，5（3）：9-11.

Effects of 3 Chinese Formulas on Bile of Drug-Induced Cholestasic Rats

Chen Fei1，2，Fang Buwu2，Wu Xianzhong3

（1.Depantment of Pharmacy，Liaocheng People′s Hospital，Liaocheng，Shandong，China 252000；2.Department of Pharmacology，Tianjin Medical University，Tianjin，China300070；3.Tianjin Institute of Acute Abdomen in Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Tianjin，China300110）

ObjectiveTo observe the influence of Chaiyu Decoction，Shaogan Decoction and Tongxie prescription on ANIT-induced cholestasic rats.Methods96 healthy Wistar rats were divided into 12 groups，namely normal control group，model group，Chaiyu Decoction groups of low，middle and high dose，Shaogan Decoction groups of low，middle and high dose，and Ursodeoxycholic acid tablet group.On day 1，rats were treated with bile duct intubation.On day 2，rats of normal control group were administered bean oil，and other groups were treated with 4%ANIT.On day 4，each group was administered corresponding drug after being colleceted bile for 1 hour in the morning，and was treated accordingly again at night，then collected bile for 1 hour.On day 5，treatment was same as day 4 except rats were not collected bile in the morning.ResultsAfter treated with three Chinese traditional prescriptions bile of rats on day 2 was remarkably increased compared with group of non-treatment.Conclusion3 traditional Chinese prescriptions Chaiyu Decoction，Shaogan Decoction，Tongxie prescription have cholagogic actions on ANIT-induced cholestasic rats.

α-nephthylisothiocyanate；Chaiyu Decoction；Shaogan Decoction；Tongxie Prescription；cholestasis

R285.5；R289.5

A

1006-4931（2015）20-0014-03

陈菲，硕士研究生，主管药师，研究方向为药理学，（电子信箱）feier802003@163.com；吴咸中，中国工程院院士，研究方向为中西医结合治疗急腹症，本文通讯作者，（电子信箱）wuxianzhong@yahoo.com.cn。

2015-02-05）

*天津市科技攻关计划重大科技项目，项目编号：05YFGDSF02600。