活性诱导性胞嘧啶脱氨基酶表达与黑素瘤侵袭转移、预后的相关性分析

彭吕娇 康晓静 伊力努尔·哈力甫 柴莉 李娜

活性诱导性胞嘧啶脱氨基酶表达与黑素瘤侵袭转移、预后的相关性分析

彭吕娇 康晓静 伊力努尔·哈力甫 柴莉 李娜

目的 探讨活性诱导性胞嘧啶脱氨基酶（AID）与黑素瘤侵袭转移、预后的关系和临床意义。方法 免疫组化SP法检测AID蛋白在80例黑素瘤、23例色素痣石蜡包埋组织切片中的表达，结合临床病理生物特性进行分析。结果 黑素瘤AID蛋白的阳性表达率53.75%（43/80），色素痣的表达率13.04%（3/23），差异有统计学意义（P＜0.05）。AID蛋白的表达与黑素瘤淋巴结转移、Clark分级、浸润深度及预后密切相关（P＜0.05），在年龄、性别、民族之间差异无统计学意义（均P＞0.05）。19例发生BRAF突变黑素瘤组织中，AID蛋白17例阳性表达，其中15例BRAFV600E突变的黑素瘤AID蛋白均阳性表达。结论 AID蛋白可能诱导了黑素瘤BRAF突变，并参与黑素瘤的侵袭、转移，与预后相关。

黑色素瘤；预后；肿瘤转移；突变；活性诱导性胞嘧啶脱氨基酶

活性诱导性胞嘧啶脱氨基酶（activation-induced cytidine deaminase，AID），是一种可以改变基因序列的基因编辑酶，其异常表达可引起非Ig基因的核苷酸序列改变，导致多种肿瘤的生成，并参与肿瘤的侵袭和转移［1-3］。位于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径的BRAF基因是黑素瘤中突变率最高的基因，也是黑素瘤特异性靶向治疗研究热点基因［4］。本课题组前期研究显示新疆地区黑素瘤中存在BRAF基因突变，并以V600E突变为主［5］。我们用免疫组化方法检测80例黑素瘤组织中AID蛋白的表达，结合前期BRAF突变检测分析，探讨AID蛋白表达与BRAF突变、黑素瘤临床病理特征的关系。

一、资料与方法

1.标本来源及特征：选取新疆维吾尔自治区人民医院病理科及皮肤科2004年1月至2013年12月明确诊断为黑素瘤的石蜡包埋组织80例及色素痣组织标本23例。所有标本均经HE染色及病理诊断证实。80例黑素瘤患者均未做化疗、放疗及抗免疫治疗，并已经前期［5］BRAF突变DNA检测。80例黑素瘤患者中维吾尔族39例，汉族41例；男42例，女38例；年龄22～94岁，平均57.5岁；浸润深度：组织学表现为原位黑素瘤（肿瘤细胞未突破基底膜）26例，侵袭性黑素瘤（肿瘤细胞突破基底膜向真皮内侵袭）54例；组织学Clark分级：Ⅰ～Ⅲ级27例，Ⅳ～Ⅴ级53例；伴随淋巴结转移32例，无淋巴结转移48例；临床预后：预后不良（3年内随访出现多器官转移或死亡）39例，预后良好24例，失访17例。

2.主要试剂：一抗是小鼠抗人AID IgG单克隆抗体（美国Invitrogen公司），鼠兔通用型二抗、二氨基联苯胺（DAB）显色剂均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

3.免疫组化SP法检测AID蛋白表达：将4%甲醛固定、石蜡包埋的黑素瘤组织制成3 μm切片，常规烤片、脱蜡、水化；浸入0.01 mmol/L pH6.0的枸橼酸盐缓冲液内，热抗原修复3 min；3%H2O2室温孵育30 min;DAB显色1 min左右；自来水冲洗，苏木精复染，通透、脱水，中性树胶封片，高分辨显微镜（日本Olympus公司）下观察。磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照。

4．结果判断：AID蛋白阳性染色为棕黄色颗粒，主要定位于细胞质。观察全片，借助高分辨显微镜随机取不重叠的5个×200视野，得出阳性细胞所占百分比。采用半定量积分法，对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞着色强度进行分级计分。染色强度分为3级：无着色0分，浅着色1分，棕黄色2分；按阳性细胞的百分比分4级：＜5%0分，5%～25%1分，26%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分。每张切片最后的得分为两次评分的乘积：≥3分是阳性，＜3分是阴性。

5.统计学方法：采用SPSSl8.0统计软件，AID蛋白在黑素瘤和色素痣组织中表达率、黑素瘤患者中AID蛋白质表达情况与患者临床病理特征的关系比较均采用χ2检验。

二、结果

1.AID蛋白在黑素瘤和色素痣组织中的表达：80例黑素瘤石蜡包埋组织中，AID蛋白阳性表达43例，为细胞质棕黄色着色，表达率为53.75%（43/80）。23例色素痣组织中检测到3例AID阳性表达，AID阳性表达率为13.04%（3/23），两组阳性表达率间差异有统计学意义（χ2＝11.977，P＝0.001）。

2.AID蛋白表达与临床病理特征的关系：AID阳性表达的黑素瘤组织多伴随淋巴结转移，且AID阳性表达率随黑素瘤组织Clark分级升高及浸润深度加深而增高（P＜0.05）。AID蛋白的表达在不同年龄、性别、民族之间分布，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 黑素瘤患者临床特征与AID蛋白质表达关系［例（%）］

在80例AID阳性表达黑素瘤患者中随访到63例患者。其中，32例AID阳性表达黑素瘤患者，在3年随访期间有15例出现了多器官转移，9例死亡，预后不良的患者占总数的75%（24/32）；而在31例AID阴性表达黑素瘤患者中预后不良的患者仅占总随访数的48%（15/31）。与AID阴性表达的黑素瘤患者相比，AID阳性的患者更易出现预后不良（P＜0.05）。

3.AID蛋白阳性表达与BRAF突变关系：将免疫组化结果与前期BRAF突变DNA检测结果［5］对比后发现，在发生BRAF突变的19例黑素瘤患者中，15例V600E突变，1例L597Q突变，1例G593C突变黑素瘤组织AID蛋白均为阳性表达；1例S465F突变与1例P453H突变黑素瘤组织中AID蛋白阴性表达。发生BRAF突变的19例黑素瘤组织中AID蛋白阳性表达率为89.5%（17/19）。发生BRAFV600E突变的15例黑素瘤组织中AID蛋白阳性表达率为100%（15/15）。

三、讨论

AID是胞嘧啶脱氨基酶家族成员之一，参与编码DNA和RNA，是免疫球蛋白基因组发生2次突变必须的酶。随后，Okura等［6］对黑素瘤患者随访发现，AID蛋白阳性表达的黑素瘤患者多表现为临床预后不良，10例中有8例在4年内出现多器官转移和/或多个淋巴结转移灶，而AID阴性表达的黑素瘤患者预后较好。本研究在43例AID阳性表达黑素瘤患者中随访到32例患者，在3年随访期间有15例出现了多器官转移，9例死亡，75%（24/32）患者预后不良，而AID阴性表达黑素瘤患者中48%（15/31）预后不良，可见AID的表达与黑素瘤预后有关。本研究还发现，Clark分级、淋巴结转移、浸润深度与AID的表达有关。AID阳性表达的黑素瘤患者多伴随淋巴结转移，且黑素瘤AID阳性表达率随Clark分级升高及浸润深度加深而增高。本研究用免疫组化法分析了AID蛋白在黑素瘤中的表达情况，发现AID阳性的黑素瘤患者较AID阴性表达的患者更易出现预后不良（P＜0.05）。AID蛋白有望成为一个重要的黑素瘤预后预测指标，对黑素瘤的预后评估有重要意义。免疫组化检测黑素瘤中的AID蛋白表达具有快速、直观、价格相对低廉等优点，能为黑素瘤患者制定个性化治疗方案提供帮助。

［1］Yoshikawa K,Okazaki IM,Eto T,et al.AID enzyme-induced hypermutation in an actively transcribed gene in fibroblasts［J］. Science,2002,296（5575）:2033-2036.

［2］Wedekind JE,Dance GS,Sowden MP,et al.Messenger RNA editing in mammals:new members of the APOBEC family seeking roles in the family business［J］.Trends Genet,2003,19（4）:207-216.

［3］Cascalho M.Advantages and disadvantages of cytidine deamination［J］.J Immunol,2004,172（11）:6513-6518.

［4］Kong Y,Si L,Guo J,et al.Aberrations of KIT,BRAF,NRAS,and PDGFRA in Chinese melanoma patients and their significance: Large,scale analysis of 644 patients［J］.J Clin Oneol,2011,29（15）:8568.

［5］郭芳,康晓静,唐小辉,等.新疆80例恶性黑素瘤BRAF基因突变分析［J］.中华皮肤科杂志,2013,46（1）:33-36.

［6］Okura R,Yoshioka H,Yoshioka M,et al.Expression of AID in malignant melanoma with BRAF（V600E）mutation［J］.Exp Dermatol,2014,23（5）:347-348.

Correlation analysis between activation-induced cytidine deaminase expression and melanoma invasion, metastasis and prognosis

Peng Lyujiao*,Kang Xiaojing,Yilinuer Halifu,Chai Li,Li Na.*Shihezi University School of Medicine,Shihezi 832002,Xinjiang,China
Corresponding author:Kang Xiaojing,Email:drkangxj666@163.com

ObjectiveTo explore the relationship between activation-induced cytidine deaminase（AID）expression and melanoma invasion,metastasis and prognosis,and to evaluate the clinical significance of AID.MethodsAn immunohistochemical study was conducted to detect the expression of AID in paraffin-embedded tissue sections from 80 cases of melanoma and 23 cases of pigmented nevus.The relationship between the expression of AID and clinicopathological and biological features of melanoma was analyzed.ResultsThe expression rate of AID was significantly higher in melanoma than in pigmented nevus tissue specimens（53.75%（43/80）vs.13.04%（3/23）,P＜0.05）.AID expression was closely correlated with lymphatic metastasis,Clark grade,depth of invasion and prognosis of melanoma（allP＜0.05）,but was of no significant difference among patients of different age,gender or nationalities（allP＞0.05）.Of 19 melanoma specimens with BRAF mutations,17 expressed AID,including all the 15 melanoma specimens with the BRAFV600E mutation.ConclusionsAID may induce BRAF mutations in melanoma,participate in melanoma invasion and metastasis,and be correlated with melanoma prognosis.

Melanoma;Prognosis;Neoplasm metastasis;Mutation;Activation-induced cytidine deaminase

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.09.015

新疆维吾尔自治区国际科技合作计划项目（20146022）

832002新疆石河子大学医学院（彭吕娇）；新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科（康晓静，伊力努尔·哈力甫）；新疆石河子大学医学院（李娜）；新疆医科大学（柴莉）

康晓静，Email：drkangxj666@163.com

2014-11-04）

（本文编辑：吴晓初）