猪皮胶原多肽螯合钙的制备及其结构表征

许先猛，董文宾，孙皎皎（1.陕西科技大学化学与化工学院，陕西西安710021；2.运城职业技术学院有机食品工程系，山西运城044000；.陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安710021）

猪皮胶原多肽螯合钙的制备及其结构表征

许先猛1，2，董文宾1，3，*，孙皎皎3
（1.陕西科技大学化学与化工学院，陕西西安710021；2.运城职业技术学院有机食品工程系，山西运城044000；3.陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安710021）

以猪皮明胶复合酶解胶原多肽和葡萄糖酸钙为原料，多肽钙螯合率为指标，在一定条件下制备多肽螯合钙。通过Plackett-Buiman（PB）和中心组合设计（CCD），考察胶原多肽/水料液比、多肽/葡萄糖酸钙质量比、pH、反应温度、反应时间、搅拌时间、搅拌速度等因素对多肽螯合率的影响。结果表明：通过PB设计筛选出多肽/葡萄糖酸钙质量比、pH和反应时间为多肽钙螯合主要影响因素，经CCD优化确定最佳螯合工艺为多肽/葡萄碳酸钙质量比5.5∶1，pH6.0，反应时间130 min，胶原多肽/水料液比1.5∶100，反应温度60℃，搅拌速度30 r/min，搅拌时间20 min。在此条件下，多肽螯合率达78.3%。采用紫外光谱、红外光谱、扫描电镜、X衍射等手段，研究了猪皮胶原多肽螯合钙的结构，结果表明猪皮胶原多肽与钙形成了螯合物，且胶原多肽的氨基和羧基均与Ca2+发生了螯合反应。

猪皮明胶，胶原多肽，螯合钙，螯合率，响应面

我国是猪肉生产和消费大国，每年大约产6亿张猪皮［1］，用于食品级明胶的生产超过20万吨。但猪皮明胶存在必需氨基酸组成缺陷、难消化、生物效价低等缺点［2］。明胶经酶解后得到的生物活性多肽在人体内吸收率较高［3］，具有多种生理功能［4］。国内外的学者们也展开多肽与钙螯合作用的研究，X-L BAO等［5］分析了多肽分子量与钙螯合的关系，李彦春等［6］通过小鼠实验证明了多肽钙补钙效果优于常规补钙制剂。

钙是人体内含量最丰富的矿物质元素，约占体重1.5%～2.0%，是骨骼和牙齿构成的重要成分，人体所有的生命活动包括神经物质的传递、心脏搏动、肌肉收缩等均需要钙的参与［7］，缺钙会引发人体等多种疾病。营养调查表明［8］，我国人群钙摄入量普遍偏低，仅达到推荐量的50%左右，因此补钙成为我国膳食营养研究中的重要课题。研究表明［9-10］，动物体内存在着小肽转运系统，小肽与钙螯合可以有效提高钙的生物利用度。肖文君等［11］发现酶解后多肽分子量主要分布在3 ku左右，本文以猪皮明胶为原料，经复合酶解和超滤制备分子量小于5 ku多肽，然后与葡萄糖酸钙进行螯合制备多肽螯合钙，采用响应面法对制备条件进行优化，并通过紫外光谱、红外光谱、扫描电镜、X衍射等手段对多肽螯合钙结构进行表征分析。以期提高猪皮明胶的营养附加值，增加企业的经济效益，同时为多肽螯合钙产品的研发提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

食品级猪皮明胶山东淄博宝恩生物科技有限公司；酸性蛋白酶（酶活≥50000 U/g） 北京奥博星生物科技有限公司；胃蛋白酶（酶活≥1200 U/g） 国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖酸钙浙江康普达生物科技有限公司；胶原多肽粉末实验室制备；盐酸、氢氧化钠、95%乙醇均为分析纯。

VERTEX 70傅立叶变换红外光谱分析仪德国Bruker公司；S-4800场发射扫描电镜日本Hitachi公司；D/max2200PC X光衍射仪日本Rigaku公司；真空冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司；XX80EL005型超滤系统美国MILLIPORE公司；微量移液器芬兰Dragonmed公司。

1.2实验方法

1.2.1猪皮胶原多肽粉末制备采用复合酶水解制备胶原多肽［12］，即先用酸性蛋白酶在温度50℃，pH6.0，料液比1∶20，酶浓度1.0%条件下水解3 h，然后用胃蛋白酶在温度45℃，pH3.0，酶浓度0.5%条件下水解3 h，灭酶。采用超滤系统制备分子量小于5 ku多肽溶液，低温真空浓缩，冷冻干燥，制得胶原多肽粉末。

1.2.2猪皮胶原多肽螯合钙制备适量胶原多肽粉末→一定比例蒸馏水溶解→调节至一定pH→加入适量葡萄糖酸钙→一定温度条件下水浴（恒温恒速搅拌一定时间）→浓缩→95%乙醇沉淀（10倍体积）→4℃静置6 h→过滤→真空冷冻干燥→多肽螯合钙［12-15］。

1.2.3多肽钙螯合率的测定准确移取2 mL多肽螯合反应液于50 mL离心管中，加入20 mL 95%乙醇溶液，振荡混匀，转速10000 r/min条件下离心10 min，EDTA法测定沉淀中钙含量，记为m0；准确移取2 mL反应液直接测定总钙含量，记为m1。可由公式（1）得多肽钙螯合率：

式中：m0—样品多肽螯合钙中钙含量；m1—样品总钙含量。

1.2.4多肽螯合钙因素筛选实验设计应用Design-Expert软件对螯合实验进行Plackett-Burman（PB）设计，对螯合过程中的7个因素进行筛选：即胶原多肽/水料液比、多肽/葡萄糖酸该钙质量比、pH、反应温度、反应时间、搅拌速度、搅拌时间，外加4个虚拟变量，如表1。每个变量分别确定（+）和（-）高低两个水平，对11个变量进行12次实验以确定其影响因子，线性模型方程式为［16］：

表1　Plackett-Burman设计因素水平Table 1　Range of different factors investigated with Plackett-Burman

1.2.5多肽螯合钙优化实验设计应用Design-Expert软件，采用Central Composite Design（CCD）方法，对PB筛选出的3个重要因素（质量比、pH、反应时间）进行实验设计，同时固定其他非关键因素［16］：料液比为1.5∶100，反应温度为60℃，搅拌速度为30 r/min，搅拌时间为20 min。

表2　中心组合设计各因素水平Table 2　Range of different factors investigated with CCD design

1.2.6紫外光谱（UV）分析配制浓度为0.2%胶原多肽和多肽螯合钙水溶液，在波长190～500 nm范围内扫描。

1.2.7红外光谱（IR）分析取适量冷冻干燥胶原多肽粉末和多肽螯合钙样品粉末，采用KBr压片法进行压片，测定在600～5000 cm-1处的红外图谱。

1.2.8扫描电镜（SEM）分析将适量的胶原多肽粉末与多肽螯合钙冻干粉末样品分别均匀涂抹于样盘，喷金镀膜处理，施加电压聚焦清晰后，在20000放大倍数获取图像。

1.2.9X衍射分析采用D/max2200PC X-光衍射仪，分析条件为Cu靶，Ka，管电压40 KV，管电流40 mA，连续扫描，扫描速度为8 deg/min，步长0.02 deg/step，扫描角度范围2θ为4°～60°。

1.2.10钙含量分析EDTA法［14］测定，取3次平行测量的平均值。

1.2.11数据处理采用Design-Expert 8.0软件处理数据。

2　结果与讨论

2.1Plackett-Burman（PB）实验设计结果与分析

Plackett-Burman（PB）实验设计结果见表3，其中（+）表示螯合条件因素高水平值，（-）表示螯合条件因素低水平值。通过螯合钙螯合率回归性分析，得到各影响因子的偏回归系数及其显著性，见表4。

表3　Plackett-Burman（PB）实验设计结果Table 3　Plackett-Burman（PB）experiment design and response values

表4　偏回归系数及影响因子的显著性分析Table 4　Partial regression coefficients and analyses of their significance

由表4结果可以看出，因素X2、X3、X4、X5、X6和X7对多肽钙螯合率的影响为正效应，即增大正效应因素的值，多肽螯合率呈增加趋势；因素X1、X8、X9、X10和X11对多肽螯合率的影响为负效应，即随着负效应因素的减小，多肽螯合率呈降低趋势。因素X2（多肽/葡萄糖酸钙质量比）、X3（pH）和X5（反应时间）为主要影响因素，其贡献值分别为65.83%，8.91%和14.95%，而四个虚拟因素对多肽钙螯合率影响值分别为0.18%、0.55%、0.14%和0.090%，说明得到的线性回归方程是可用的。以多肽钙螯合率为响应值得到的线性回归方程为：

表5　多肽钙螯合率回归模型方程的方差分析Table 5　Analyses of variance for the regression model equation of enzyme activity yield

由表5可以看出，方差分析模型的Prob＞F（p）值为0.0003，表明所得回归性方程极显著，即该模型在整个研究区域拟合的很好；相关系数R2=0.8969，说明相关性很好；精密度为13.185，本实验设计合理。

综上得到，胶原多肽/水料液比为1.5∶100，反应温度为60℃，搅拌速度为30 r/min，搅拌时间为20 min，多肽/葡萄碳酸钙质量比、pH、反应时间进行下一步优化。

2.2CCD优化设计结果与响应面分析

通过对多肽/葡萄糖酸钙质量比、pH和反应时间进行中心组合设计（表6），得到相应的二次方程模型：

式中：Y是响应值，即多肽螯合钙的螯合率；A、B和C分别表示多肽螯合过程中质量比多肽/钙盐、溶液pH和反应时间。

对实验结果进行拟合的二次模型方差分析，结果见表7。F值为23.87，多元相关系数为R2=0.9555，回归方程达到极显著水平（p＜0.01），且失拟项不显著（p＞0.05），说明该模型预测值与实际实验值拟合较好，可以利用该回归方程对结果进行分析，对响应值进行预测。

二次模型中回归系数的显著性检验表明（表8）：因素A、B、C对多肽钙螯合效果影响极显著（p＜0.01）；AB、AC、BC对多肽钙螯合效果的交互影响不显著；因素A2、B2对多肽钙螯合效果的影响极显著（p＜0.01）、C2影响显著（p＜0.05）。利用Design-expert 8.0软件在设定的因素水平内对回归方程进行数学规划，得到螯合率最高的优化组为：多肽/葡萄碳酸钙质量比5.49∶1，pH5.94，反应时间129.76 min。在此条件下，螯合率的理论值为79.27%。

表6　中心组合设计及结果Table 6　CCD design and response values

表7　中心组合设计二次模型方差分析Table 7　Analyse of variance for the regression quadratic model equation of CCD design

表8　二次模型回归方程系数显著性检验Table 8　Coefficient estimates by the regression quadratic model

2.3验证实验

考虑到实际操作，将以上优化条件校正为多肽/葡萄碳酸钙质量比5.5∶1，pH6.0，反应时间130 min，在胶原多肽/水料液比1.5∶100，反应温度60℃，搅拌速度30 r/min，搅拌时间20 min的条件下，进行了螯合钙的制备验证实验（重复三次取平均值），实测螯合率为78.3%，与预测值79.27%较接近，预测精度达98.78%，证明了PB和CCD方法连用优化多肽螯合制备条件具备一定的可行性和准确性。

2.4紫外光谱（UV）分析

将胶原多肽和胶原多肽螯合钙的水溶液在190～500 nm之间进行紫外扫描，扫描结果见图1。

图1　胶原多肽和胶原多肽螯合钙的紫外吸收曲线Fig.1　Ultraviolet absorption curve of collagen peptide and collagen peptide chelating calcium

由图1可以看出，胶原多肽的最大吸收峰在231 nm，而与肽螯合以后，胶原多肽螯合钙最大吸收峰在224 nm，最大吸收峰发生了明显的位移，这主要是胶原多肽和钙螯合后螯合物中央离子与配位体键合的配合体内部电子的跃迁与游离配位体内部电子的跃迁时要求的能量不同，相应原子的价电子跃迁不同，多肽螯合钙螯合过程中其配体对光吸收性能发生了改变，因此，表明有新物质生成，证实了胶原多肽和钙离子之间可能发生了螯合反应。

2.5红外光谱（IR）分析

采用KBr压片法对胶原多肽粉末和多肽螯合钙粉末进行压片，并测定胶原多肽和多肽螯合钙在600～5000 cm-1的红外图谱，见图2。

图2　胶原多肽和胶原多肽螯合钙的红外光谱图Fig.2　Infrared spectral analysis of collagen peptide and collagen peptide chelating calcium

胶原多肽和胶原多肽螯合钙样品的红外光谱图见图2，胶原多肽红外光谱图的特征区中，-NH2的吸收峰在3228.75 cm-1，是由N-H的伸缩振动所引起的；指纹区，C=O的吸收峰在1620.16 cm-1，-COO-的吸收峰在1396.42 cm-1。而胶原多肽螯合钙红外光谱图的特征区中，-NH2的吸收峰移动到了3303.97 cm-1；指纹区，C=O的吸收峰移动到了1651.02 cm-1，-COO-的吸收峰移动到了1438.85 cm-1。蛋白质中羧基和酰胺红外特征吸收峰的变化可以反映蛋白质中有机配体与金属离子发生了相互作用［17］，比较胶原多肽螯合钙和胶原多肽的红外光谱，可以看出胶原多肽螯合钙的红外光谱与胶原多肽的红外光谱发生了明显的变化，多肽中氨基和羧基均参与了钙的螯合反应。

2.6扫描电镜（SEM）分析

胶原多肽与胶原多肽螯合钙的电镜扫描结果如图3。

图3 电镜扫描图谱Fig.3　Scanning pattern by eLectron microscope

图3是胶原多肽和胶原多肽螯合钙的电镜扫描图片，图3a～b为胶原多肽在20 k和50 k倍数下的电镜照片，从图中可以看出胶原多肽呈现光滑均匀平面，同时存在一定裂纹，这应该是胶原多肽分子量较小（小于5 ku），胶原多肽组织状态较均匀细腻，裂纹应该是胶原多肽在快速真空冷冻干燥后留下的裂纹。图3c～d为胶原多肽螯合钙20 k和50 k倍数下的电镜照片，从图中可以看出许多不规则固体骨架嵌入平面内部，而且平面表面粗糙，无裂纹出现，应该是胶原多肽与钙发生了螯合，同时吸附了一定的螯合钙晶体，胶原多肽与钙螯合后交联性较强，经快速真空冷冻干燥后不会对产品状态产生影响和裂纹破坏现象。

2.7X衍射分析

胶原多肽与胶原多肽螯合钙的X衍射结果如图4。

图4X衍射图谱Fig.4　X-Ray Spectrum Analysis

图4是胶原多肽和胶原多肽螯合钙的X衍射图谱，由图4a可见，胶原多肽在2θ为21.85°附近出现衍射峰，但吸收峰本底较大，吸收峰强度不大，说明胶原蛋白被很大程度降解为胶原多肽，胶原多肽为无规则的非晶型结构。由图4b可见，胶原多肽与钙离子形成螯合物后，X衍射图谱发生了较大的变化，胶原多肽螯合钙在2θ为8.18°、9.22°、17.44°、20.96°、22.62°、24.42°、27.38°处各有一个尖峰，而且图谱本底小，衍射峰高且尖锐，晶型较好。说明胶原多肽与钙发生了反应，生成了新的物质。

3　结论

通过Plackett-Buiman（PB）和中心组合设计（CCD），分析优化确定最佳螯合工艺为，胶原多肽/水料液比1.5∶100，反应温度60℃，搅拌速度30 r/min，搅拌时间20 min，多肽/葡萄碳酸钙质量比5.5∶1，pH6.0，反应时间130 min，此条件下多肽螯合率达78.3%，螯合率较白鲢鱼骨、皮等为原料制备螯合钙低［13-15］，但对猪皮资源的开发和利用有着重要意义。同时，采用紫外光谱、红外光谱、扫描电镜、X衍射等手段对胶原多肽和多肽螯合钙进行分析，结果表明，胶原多肽和多肽螯合钙化学结构上发生了一定的变化，证明了胶原多肽螯合钙的形成。

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Preparation and characterization of pigskin polypeptide chelating calcium

XU Xian-meng1，2，DONG Wen-bin1，3，*，SUN Jiao-jiao3
（1.College of Chemistry and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China；2.Department of Organic Food Engineering，Yuncheng Vocational and Technical College，Yuncheng 044000，China；3.College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi’an 710021，China）

In this paper，the combination between collagen polypeptide and calcium gluconate was studied based on the preparation of collagen polypeptide from pigskin gelatin by measuring chelate rate.Plackett-Burman（PB）design and central composite design（CCD）were applied to screen and optimize 7 factors（solidliquid ratio，ratio of collagen polypeptide to calcium gluconate，pH，reaction temperature，reaction time，agitation speed and mixing time）for the calcium binding capacity.The ratio of collagen polypeptide to calcium gluconate，pH and the reaction time were the main factors of chelated calcium by PB design.The optimal chelate condition was determined as：ratio of collagen polypeptide to calcium gluconate 5.5∶1（W/W），pH6.0，reaction time 130 min，solid-liquid ratio 1.5∶100，reaction temperature 60℃，agitation speed 30 r/min，and mixing time 20 min and the chelate rate of Ca-collagen polypeptide could reach 78.3%.The structure of chelated calcium was characterized by the UV-VIS，FT-IR，SEM and X-ray.The research confirmed the chelating reaction between calcium ion and collagen polypeptide，and the coordination reaction between calcium and carboxyl/amino group of collagen polypeptide occurred.

pigskin gelatin；collagen polypeptide；chelated calcium；chelate rate；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2015）20-0309-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.055

2015－01－30

许先猛（1984-），男，博士，研究方向：功能食品开发研究，E-mail：xuxianmeng@sina.com。

董文宾（1951-），男，教授，研究方向：食品安全性与新材料制备，E-mail：dongwb@sust.edu.cn。

山西省高等学校科技创新项目（20141123）；国家“十二五”科技支撑计划项目（2012BAD12B07-05）。