酶法-超声波辅助提取香椿叶中总黄酮及抗氧化活性研究

刘智峰（陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西汉中723000）

酶法-超声波辅助提取香椿叶中总黄酮及抗氧化活性研究

刘智峰
（陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西汉中723000）

研究了酶法-超声波辅助提取香椿叶总黄酮的工艺条件及其抗氧化活性。通过Plackett-Burman筛选出影响最显著的三个因素：纤维素酶用量、pH和超声提取功率，进行三因素三水平的响应面实验，优化了香椿叶总黄酮的酶法-超声波提取工艺条件，以香椿叶总黄酮提取液清除羟自由基和DPPH自由基来评价其抗氧化活性。得到的最佳工艺参数为：酶解温度和超声提取温度均为60℃，料液比1∶30 g/mL，乙醇体积分数70%，超声提取时间40 min，纤维素酶用量8 mg/g，pH=5.6，超声提取功率为220 W，此条件下香椿叶总黄酮得率达到33.166 mg/g。抗氧化结果表明香椿叶总黄酮具有一定的抗氧化能力，香椿叶总黄酮提取液对羟自由基和DPPH自由基清除率的IC50分别为22.85、53.74μg/mL。

响应面，总黄酮，香椿叶，抗氧化活性

香椿（Toona sinensis）是我国传统的经济速生树种，目前主要以叶子作为香椿的经济支柱。香椿叶具有特殊的香味，作为绿色菜肴食用已经有很长一段时间。香椿叶同时还具有一定的保健及预防疾病作用，可以作为天然的食品防腐剂、抗氧化剂使用。目前开发的香椿叶类相关产品包括香椿酱、香椿芽复合保健饮料等［1-4］。随着研究的不断深入发现香椿叶的香味源于其中的活性成分总黄酮，李秀信等［5-9］对香椿叶中黄酮类成分进行了定性分析和定量测定，测定结果显示香椿叶中含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等黄酮类化合物，在降血糖、抗氧化、抗痛风、抗衰老方面具有突出效果，为开发香椿叶保健食品提供了理论依据。

目前已经报道的香椿叶总黄酮提取方法有微波法、超声波法、超临界二氧化碳法、酶法等，其中酶法提取反应温和，在酶解作用下细胞膜破裂，传质阻力减小，加速了目标提取物的溶出速率，提取效果好，一般无需其他外加能耗，工艺简单，提取物的有效成分能得到很好的保护；超声波法借助超声波的空化及机械作用能有效促进目标提取物的溶出，超声波的机械震动还具有一定的杀菌及絮凝效果，有利于后期精制［10-11］。酶法辅-超声波辅助提取香椿叶总黄酮在国内未见报道，本文结合酶法和超声波提取技术的优点，探究了提取过程中各因素对得率的影响，通过Blacket-Burman筛选出实验中影响较大的因素作为响应面实验的影响因子对酶法-超声波提取香椿叶黄酮进行工艺优化，并对其抗氧化活性进行研究，旨在为香椿叶在食品工业中的高效综合利用提供理论参考。

1　材料及方法

1.1材料与仪器

香椿叶汉中植物园采摘，50℃恒温干燥，粉碎过80目筛，阴凉干燥处保存待用；芦丁中国药品生物制品检验所，纯度≥98%；纤维素酶15000 U/g，国药集团化学试剂有限公司；乙醇、NaNO2、Al（NO）3、醋酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、抗坏血酸（VC）、2，2-二苯代苦味酰基苯肼基（DPPH）等均为分析纯。

pHS-3TC（0.01级）精密酸度计上海天达仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗机昆山市超声仪器有限公司；DHG-9075A型电热鼓风箱上海一恒科技有限公司；Cary50型紫外可见分光光度计美国瓦里安；FW117中草药粉碎机天津泰斯特仪器有限公司；SHZ-D9（Ⅲ）循环水式真空泵巩义市予华仪器有限公司；GR-200电子天平日本AND；80-1型离心机江苏金坛正基仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1芦丁标准曲线的绘制根据文献采用NaNO2-Al（NO3）3比色法的测定结果绘制芦丁标准曲线［12］。以芦丁标准溶液的浓度为横坐标，测定的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到的回归方程为：A=15.05C+ 0.0114，R2=0.9984，回归方程中的A表示吸光度值，C表示芦丁标准溶液，mg/mL。

1.2.2香椿叶总黄酮的提取将香椿叶粉末精密称取1.000 g，倒入50 mL的锥形瓶中，按一定的料液比加入不同体积分数的乙醇中，再加入缓冲液调节pH，在恒温水浴槽中进行酶解。酶解完成后转移至设定好参数的超声波清洗机中进行超声波提取，得到的提取液经过抽滤、2000 r/min离心6 min，取上清液作为提取液的最终测定样本，采用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定香椿叶总黄酮吸光度，计算得率。

1.2.3香椿叶总黄酮得率计算将测定的香椿叶总黄酮的吸光度A代入标准曲线方程中求出提取液中的总黄酮浓度C，按下式计算得率。

式中：V—测定液的体积（mL）；C—香椿叶总黄酮测定样品液浓度（mg/mL）；X—香椿叶总黄酮提取液稀释总倍数；W—每次提取加入的香椿叶质量（g）。

1.2.4实验设计

1.2.4.1单因素实验设计选取影响酶法-超声波辅助提取香椿叶中影响总黄酮得率的八个因素，在各因素实验水平范围内考察单因素水平变化对香椿叶总黄酮的得率的影响。

每次实验称取1.0000 g香椿叶粉末，放入50 mL的锥形瓶中，加入乙醇溶液，添加纤维素酶，用缓冲液调节pH，一定温度下酶解1 h后，设定超声波提取条件进行超声波提取，考察各因素对香椿叶总黄酮得率的影响。提取条件设定为乙醇体积分数60%，纤维素酶用量8 mg/g，pH=5，超声提取时间30 min，超声提取功率120 W，超声提取温度60℃，料液比为1∶30 g/mL。在探究单因素对香椿叶总黄酮得率的影响时分别变化对应的设定因素，其他条件不变。

纤维素酶用量的考察水平分别为：2、5、8、11、14 mg/g；料液比的考察水平分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL；pH的考察水平分别为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5；超声提取功率考察水平分别为120、150、180、210、240 W；酶解温度考察水平分别为40、50、60、70、80℃；超声提取温度分别为40、50、60、70、80℃；乙醇体积分数考察水平分别为50%、60%、70%、80%、90%；超声提取时间的考察水平分别为20、30、40、50、60 min。

1.2.4.2Plackett-Burman实验设计由于实验探究的单因素较多，在单因素实验的基础上，采用Blacket-Burman设计筛选出影响较大的几个因素作为响应面实验的影响因子，通过Plackett-Burman对单因素实验的八个因素进行考察，依次标为A～H，每个因素取低水平“-1”和高水平“1”，响应值为香椿叶总黄酮得率。因素水平表见表1。

表1　Plackett-Burman实验因素水平表Table 1　Factors and levels of Plackett-Burman

1.2.4.3响应面实验设计在单因素实验的基础上，将Plackett-Burman实验设计优选出的三个对香椿叶总黄酮得率影响较大的因素纤维素酶用量、pH、超声提取功率作为响应面实验设计的变量，香椿叶总黄酮得率作为响应因子，根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，进行三因素三水平响应面实验优化设计，实验因素水平表见表2。实验过程中其他影响不显著的因素分别设定为：酶解温度和超声提取温度均为60℃，料液比1∶30 g/mL，乙醇体积分数70%，超声提取时间40 min。

表2　响应面实验因素水平表Table 2　Factors and levels of central composition design test

1.2.5香椿叶总黄酮的抗氧化活性实验研究

1.2.5.1清除羟自由基活性研究参照文献［13-14］，将酶法-超声波最佳工艺条件下提取的香椿叶总黄酮提取液配制成10、20、30、40、50、60、70、80、90 μg/mL质量浓度的溶液九份，相同质量浓度的VC作为对比，每个质量浓度的提取液均取2.00 mL移入25 mL的容量瓶中，依次加入6.0 mmol/L的硫酸亚铁2.0 mL，1.0 mmol/L的双氧水2.0 mL混合均匀，静置10 min后再加入6.0 mmol/L的水杨酸2.0 mL，反应30 min于510.00 nm处测定吸光度，记为A0，用双氧水代替水杨酸测得的吸光度记为A1，以蒸馏水代替提取液所测得的吸光度记为A2。每次实验重复三次，以其平均值作为最终的实验值，按下式计算清除率。

1.2.5.2清除DPPH自由基活性研究参照文献［14-15］，将酶法-超声波最佳工艺条件下提取的香椿叶总黄酮提取液配制成10、30、50、70、90、110、130、150、170 μg/mL质量浓度的溶液九份，每个质量浓度的溶液均取2.0 mL移入10 mL的具塞试管中，再加入2.0 mL浓度为0.06 mg/mL的DPPH自由基溶液（用60%体积分数的乙醇溶解0.06 mg的DPPH自由基，转移到100 mL棕色的容量瓶中定容），混合均匀后反应30 min，于4000 r/min离心10 min，取上清液在波长517.00 nm处测定吸光度，记为A0；另移取2.0 mL不同质量浓度的黄酮溶液于10 mL的具塞试管中，分别加入无水乙醇2.0 mL，在波长517 nm处测定其吸光度，记为A1；以2.0 mL 0.03 mg/mL的DPPH自由基溶液和2.0 mL无水乙醇反应作为参比测定吸光度，记为A2，以VC作为对照，每个实验平行测定三次，取平均值作为最终实验数据。按下式计算清除率：

1.3数据分析

为了保证实验数据的精确度，本实验中均采用五次平行实验，实验数据处理采用软件Oringe 8.0，IC50的计算采用Matlab2013版，回归分析采用SAS 8.0。

2　结果与分析

图1　纤维素酶用量对香椿叶总黄酮得率的影响Fig.1　Effect of cellulase dosage on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1单因素实验结果

2.1.1纤维素酶用量对香椿叶总黄酮得率的影响纤维素酶能破坏香椿叶的细胞壁，有助于总黄酮的溶出。由图1可知，纤维素酶用量在8 mg/g时香椿叶中总黄酮的得率最大，此时酶解比较完全；纤维素酶添加量较少，香椿叶的细胞壁破坏不完全，黄酮不能全部释放出来；随着纤维素酶用量的增多，酶解的同时也有一部分纤维附着在香椿叶颗粒表面，堵塞了黄酮的部分溶出通道［16］，因此得率略有减小，故8 mg/g纤维素酶的效果较好。

图2　料液比对香椿叶总黄酮得率的影响Fig.2　Effect of the solid to liquid ratio on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.2料液比对香椿叶总黄酮得率的影响由图2可知，并不是料液比越大得率越高。料液比在1∶30 g/mL时香椿叶总黄酮的得率最大，料液比较小，一方面传质速率小，另一方面酶在提取剂中分散太集中容易粘结，活性受到影响，因此提取效果不好；料液比增大得率不增反减，随着提取剂量的增加，纤维素酶与底物的浓度也减小，酶解效果变差。高料液比溶剂耗量大且提取效果不明显，对于优化工艺来说没有太大意义，因此1∶30 g/mL是最佳料液比。

图3　pH对香椿叶总黄酮得率的影响Fig.3　Effect of pH on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.3pH对香椿叶总黄酮得率的影响由图3可知，pH在3.5～5.5范围内香椿叶总黄酮得率不断增大，pH=5.5时提取最大，之后得率明显降低。过高或过低的pH均会影响纤维素酶的活性及构象，同时pH也会影响底物的解离状态，阻碍部分底物与纤维素酶的结合，直接影响酶解效果［17］。pH=5.5时纤维素酶的活性最好，利于香椿叶总黄酮的提取，因此，选择pH= 5.5较好。

2.1.4超声提取功率对香椿叶总黄酮得率的影响由图4可知，香椿叶总黄酮得率随超声提取功率的增大而增大，超过210 W后得率减小；超声提取功率较弱产生的机械及空化效应对细胞壁的破坏程度小；超声波功率大，在强大机械振动作用下，提取剂流动加快导致超声波的停留时间减小，同时空化总用增强后产生的大量无用空化泡会增加超声波的散射衰减，因此得率降低。综合来看，选择210 W为较佳的超声提取功率。

图4　超声提取功率对香椿叶总黄酮得率的影响Fig.4　Effect of ultrasonic extract power on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

图5　酶解温度对香椿叶总黄酮得率的影响Fig.5　Effect of enzymolysis temperature on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.5酶解温度对香椿叶总黄酮得率的影响温度对酶的活性有着较大的影响，酶在适宜的温度下才会有效的进行酶解反应，所以温度是酶解过程中一个重要的影响因素。由图5可知，酶解温度在50～70℃之间，香椿叶总黄酮得率的增幅不是很明显，但超过70℃之后得率下降。低温不足以激发纤维素酶的活性，高温又容易使纤维素酶失活而且能耗高，综合考虑，60℃是较佳的酶解温度。

图6　超声提取温度对香椿叶总黄酮得率的影响Fig.6　Effect of temperature of ultrasonic on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.6超声提取温度对香椿叶总黄酮得率的影响从图6香椿叶总黄酮得率与超声提取温度的关系图中可以看出，超声提取温度对香椿叶总黄酮提取的影响没有其他因素明显，主要是因为前期酶解反应的温度适宜，有助于香椿叶总黄酮的提取，超声波再次强化了提取效果，但在高温下总黄酮中部分热敏性物质结构发生变化，温度超过60℃得率减小。选择60℃作为较佳的超声提取温度。

图7　乙醇体积分数对香椿叶总黄酮得率的影响Fig.7　Effect of ethanol volume fraction on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.7乙醇体积分数对香椿叶总黄酮得率的影响由图7可以看出，香椿叶总黄酮得率随乙醇体积分数的增大总体呈先增大后减小的趋势。因为不同体积分数的乙醇的极性不同，乙醇体积分数在60%～70%之间，香椿叶总黄酮的得率增加不明显，但从节省能耗方面考虑，选择60%的乙醇体积分数得率较大，且节省乙醇用量。

图8　超声提取时间对香椿叶总黄酮得率的影响Fig.8　Effect of treatment time of ultrasonic on the extraction of total flavonoids from Toona sinensis leaves

2.1.8超声提取时间对香椿叶总黄酮得率的影响从图8可以看出，香椿叶总黄酮得率随超声提取时间的延长而增加，超声提取时间在20～40 min范围内，总黄酮得率随着时间的延长不断增大，40 min后得率基本上保持不变，继续延长超声提取时间加大提取成本，40 min的超声提取基本上能将香椿叶总黄酮提取完全，综合来看，超声提取时间选取40 min。

2.2Plackett-Burman实验结果及分析

根据1.2.4.2进行实验，实验结果见表3，采用SAS 8.0软件对实验数据进行逐步回归分析，各因素的显著性检验见表4。

表3　N=12的Plackett-Burman实验结果Table 3　The result of N=12 Plackett-Burman

表4　各因素的显著性检验Table 4　Significance test of each factor

Plackett-Burman回归模型的p=0.024384＜0.05，模型显著，具有一定的统计学意义。由表3中的回归系数及Pr＞|T|可知，八个因素中纤维素酶用量、pH和超声提取功率对香椿叶总黄酮得率影响显著，因此作为响应面实验的三个影响因素进行工艺优化，其他因素在实验时设定为单因素实验确定的最佳水平。

2.3响应面实验及结果分析

按照Box-Benhnken实验设计进行实验，结果见表5。表5中1～12号是析因实验，用来检验模型的拟合度；13～15号为零点实验，用来估算实验误差。

表5　Box-Behnken设计方案及响应值Table 5　Box-Behnken design and response value

响应面实验中的三因素对香椿叶总黄酮得率的影响并非简单的线性关系，因此采用SAS 8.0中的RSREG对表5中的结果进行多元回归分析，回归方程方差分析结果见6。

表6　回归方程方差分析结果Table 6　Results of analysis of variance of regression equation

利用RSREG对表5中的实验结果进行分析，得到的香椿叶总黄酮得率数学模型回归拟合后的回归方程为：

Y=33.231-0.881625X1+1.104375X2+1.102X3-5.28125X12-1.0445X1X2+2.28525X1X3-8.36575X22+ 1.04475X2X3-2.5395X32

从表6的回归分析可知，回归模型的显著系数R2=0.9933，模型调整系数AdjR2=0.9813；方程的失拟项p=0.1168，大于显著统计水平0.05，说明模型已经尽量避免了失拟因素的影响，显著系数表明99.33%的响应都源自所选因素的变化，模型能解释98.13%的响应值的变化，因此可以判断此模型拟合效果好，可靠性高，可用此回归方程对香椿叶总黄酮的得率进行预测。

一次项中pH和超声提取功率对模型影响极显著（p＜0.01），纤维素酶添加量对模型影响显著（p＜0.05），各因素对香椿叶总黄酮得率影响的先后顺序为：pH＞超声提取功率＞纤维素酶用量，和Plackett-Burman筛选结果相吻合。二次项均体现出极显著统计水平，从表6中还可看出X1和X3的交互作用极显著，X1X2、X2X3的交互作用达到了0.05显著统计水平，说明各因素之间并非简单的线性关系，提取过程中要严格控制各因素的变化水平。

回归模型预测的香椿叶总黄酮的最佳提取工艺条件为：纤维素酶用量0.00790172 g、pH=5.582168、超声提取功率为216 W，其他条件设定均为单因素选取的最佳值。考虑到实际的可操作性，将最佳工艺条件进行修正，选择纤维素酶用量8 mg/g、pH=5.6、超声提取功率220 W，在此条件下提取3次，得率分别为33.147、33.026、33.324 mg/g，将得率的平均值33.166 mg/g作为最佳工艺条件下的香椿叶总黄酮得率，与预测值33.847 mg/g的误差仅为2.01%，说明此模型的可靠性高，可用于香椿叶总黄酮酶法-超声波提取模型预测。

图9　清除羟自由基实验结果Fig.9　Result of the·OH scavenging test

2.4香椿叶总黄酮抗氧化活性研究

2.4.1香椿叶总黄酮清除羟自由基活性清除羟自由基活性实验研究结果见图9。由图9可知，总黄酮和VC对羟自由基的清除效果均与质量浓度呈正比关系，总体来看，VC清除羟自由基效果比香椿叶总黄酮提取液好。香椿叶总黄酮提取液的IC50为22.85 μg/mL，香椿叶总黄酮提取液质量浓度在50～60 μg/mL范围内清除羟自由基能力大于VC，说明香椿叶总黄酮具有很好的清除羟自由基能力，作为绿色食品抗氧化剂及保健食品原料具有一定的发展潜力。

图10DPPH自由基清除实验Fig.10　Result of the DPPHo scavenging test

2.4.2清除DPPH自由基活性清除DPPH自由基活性实验研究结果如图10所示。由图10可以看出香椿叶总黄酮提取液清除DPPH自由基效果明显比VC差。在低浓度范围内，随着总黄酮提取液质量浓度的增大，DPPH自由基的清除率增长较快，浓度大于110 μg/mL之后清除率基本不变，而大于此浓度下的VC的清除率依然增大。香椿叶总黄酮提取液的IC50为53.74 μg/mL。

3　结论

3.1对酶法-超声波提取过程中的影响因素进行单因素实验分析，通过Plackett-Burman筛选了对实验影响显著的三个因素，响应面对酶法-超声波提取香椿叶总黄酮的工艺进行优化，得到最佳工艺参数：纤维素酶用量8 mg/g、pH=5.6、超声提取功率为220 W，酶解温度和超声提取温度均为60℃，料液比1∶30 g/mL，乙醇体积分数70%，超声提取40 min。酶法-超声波提取香椿叶总黄酮得率达到33.166 mg/g，比单独使用酶法提取高出34.22%［18］，耗时短，能耗低，值得在天然产物提取中推广。

3.2抗氧化实验结果表明香椿叶总黄酮提取液对羟自由基及DPPH自由基具有一定的清除能力，清除效果与浓度呈正比关系，可作为天然食品抗氧化剂应用。天然黄酮具有多种生物活性，作为食品添加剂具有一定的保健效果。香椿叶总黄酮在食品工业中应用潜力巨大，后期还需进一步的深入研究，开发香椿叶的潜在应用价值。

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Study on enzymatic-ultrasonic assisted extraction of total flavonoids from Tone sinensis and its anti-oxidation activities

LIU Zhi-feng
（College of Chemistry&Environmental Science of Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China）

The extraction and anti-oxidation activities of total flavonoids from Toona sinensis leaves by enzymaticultrasonic were studied.Cellulase dosage，pH and ultrasonic power were screened out by Plackett-Burman as the significant affected factors.The optimum extraction conditions were established by using 3 factors and 3 levels response surface experiment.The result showed that the optimal extraction conditions of total flavonoids were the hydrolysis temperature and ultrasonic extraction temperature of 60℃，the solid-to-solvent of 1∶30 g/mL，the ethanol concentration of 70%，ultrasonic extraction time of 40 min，cellulase dosage of 8 mg，pH=5.6，ultrasonic extraction power of 220 W，the extraction rate under this condition reached 33.166 mg/g.The antioxidation activity experiments results showed that the IC50of·OH and DPPH·scavenging rate were 22.85 μg/mL and 53.74 μg/mL respectively.

response surface method；total flavonoids；Toona sinensis leaves；anti-oxidation activities

TS201.1

B

1002-0306（2015）20-0314-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.056

2015－02－09

刘智峰（1979-），男，硕士，研究方向：生物资源利用与环境保护，E-mail：lzhifeng2005@163.com。

陕西省科技厅社发攻关基金（2011K17-03-10）；陕西理工学院科研项目（SLGKY14-11）。