三物白散对Survivin-RNA基因沉默转染胃癌SGC-7901细胞的影响*

王燚霈朱莹

（湖南中医药大学第二附属医院，湖南长沙410005）

·研究报告·

三物白散对Survivin-RNA基因沉默转染胃癌SGC-7901细胞的影响*

王燚霈朱莹△

（湖南中医药大学第二附属医院，湖南长沙410005）

目的观察中药三物白散对含存活素（Survivin）基因沉默的慢病毒颗粒（Survivin-RNAi-LV）转染人胃癌SGC-7901细胞的影响。方法分别采用RT-PCR（聚合酶链式反应）、Western blot方法检测人胃癌SGC-7901细胞中Survivin mRNA和蛋白的表达；采用甲基噻唑基四唑（MTT）方法检测胃癌SGC-7901细胞的增殖情况、流式细胞仪检测凋亡率及三物白散对其增殖抑制率及凋亡率的影响。结果重组慢病毒颗粒介导的Survivin基因沉默转染人胃癌SGC-7901细胞可有效使Survivin mRNA和蛋白的表达沉默；三物白散对人胃癌SGC-7901细胞的生长具有抑制作用，并诱导肿瘤细胞凋亡；Survivin基因沉默转染胃癌SGC-7901细胞组应用三物白散，其细胞增殖弱于、细胞凋亡率高于三物白散+空白对照组和三物白散+阴性对照组（P＜0.05）。结论含Survivin基因沉默的重组慢病毒颗粒转染人胃癌SGC-7901细胞，能够抑制SGC-7901细胞Survivin的表达，三物白散对Survivin基因沉默转染后胃癌细胞的杀伤力较未转染细胞有明显的提高。

三物白散Survivin基因沉默胃癌SGC-7901细胞影响

本课题组前期采用三物白散加减治疗进展期胃癌能明显改善患者症状［1］，但仍不能达到满意的疗效，如何提高中药的疗效，成了亟需我们深入研究的课题。基因沉默是调节真核生物细胞基因表达的一种重要方法，采用基因沉默来抑制信号通路的异常表达而治疗恶性肿瘤被越来越多的学者认可［2-3］。多项研究［4-6］发现基因沉默的方法可有效提高化疗药物对癌细胞的杀伤力，增强药物敏感性，而能否增加中药敏感性的报道鲜见。因此，本实验采用含Survivin基因沉默的慢病毒颗粒转染人胃癌SGC-7901细胞，再加不同浓度的三物白散进行实验，初步探讨三物白散对Survivin基因沉默转染胃癌细胞的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1细胞株及慢病毒人胃癌细胞SGC-7901购自中南大学湘雅医院肿瘤研究所。含Survivin基因沉默的慢病毒颗粒由上海Genechem公司重组构建。

1.2药物三物白散：巴豆、浙贝母、桔梗，药材由湖南中医药大学第二附属医院门诊中药房提供，粉碎并充分混匀，调成0.005 g/mL药物混悬液，含10%油的巴豆霜、贝母、桔梗比例为1∶3∶3，灭菌后4℃封存于玻璃安瓿。

1.3试剂DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清购自于杭州四季青公司。Trizol试剂、聚合酶链式反应（RTPCR）试剂盒、Western Blot试剂检测盒（上海生工生物工程有限公司）。兔抗人一抗Survivin抗体、羊抗兔二抗IgG抗体分别购自于Santa Cruz Biotechnology美国公司、美国Abcam公司。甲基噻唑基四唑（MTT试剂）、二甲基亚砜（DMSO）分别购自美国Sigma公司、长沙凯诺生物科技有限公司；Annexin-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（上海高创化学科技有限公司）。

1.4实验方法1）细胞培养。人胃癌SGC-7901细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱内常规培养传代。2）慢病毒颗粒转染人胃癌SGC-7901细胞。选取生长良好的处于对数生长期的人胃癌SGC-7901细胞，每孔5×105个细胞接种于备好的6孔板中，用DMEM培养基（10%胎牛血清，无抗生素），继续培养细胞，当贴壁60%左右时，将SGC-7901细胞分为3组：空白对照组（DMEM培养基）、阴性对照LV-RNAi组（空载体慢病毒颗粒2.5× 109TU/mL）、Survivin-RNAi-LV组（含Survivin基因沉默的重组慢病毒颗粒2.5×109TU/mL），接着进行转染，参照转染手册，7.0 μL/孔。转染6 h后将浓度为10% DMEM培养基更换为20%，24 h后，继续常规更换培养液，待6孔板被细胞长满后，胰酶消化，进行后续PCR、蛋白检测等实验。3）RT-PCR检测Survivin mRNA的表达。收集上述步骤3组的细胞，Trizol方法提取总RNA，参照逆转录试剂盒操作说明，逆转录合成cDNA，然后进行目的基因Survivin扩增和GAPDH内参扩增。Survivin上游引物：5′-GCGTGAGCGGGACGTAAT-3′。下游引物：5′-GTGCCCAGGGTACGTGATG-3′，扩增长度为337 bp。内参GAPDH。上游引物：5′-CTGCCCCTG GCAGCCCTTTC-3′。下游引物：5′-CTCTGGCCCAGCCTTCCA-3′，长度为182 bp。反应条件：首先94℃时预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环。取5 μL PCR产物，电泳检测，经2%琼脂糖凝胶进行，Quantity One软件对凝胶成像照片进行分析，进行3次实验，取平均值。4）Western blot检测Survivin蛋白的表达。将2）中3组SGC-7901细胞，弃培养液，PBS冲洗，去PBS液，在冰上裂解细胞，提取80～100 μg总蛋白，在10% SDS-PAGE胶上电泳，通过恒流电1.5 h转移印迹到聚偏二氟乙烯膜（polyvinyli-dene fluoride，PVDF膜），用TBST配制成5%脱脂牛奶，加入兔抗人Survivin一抗，常温下孵育2 h，置于羊抗兔IgGⅡ抗体（稀释1∶2000）中，常温下继续孵育2 h，TBST液洗膜，重复洗膜3次，每次10 min，ECL发光液中进行显色曝光处理。5）MTT法检测三物白散对Survivin基因沉默转染胃癌SGC-7901细胞后抑制率的影响。实验设3组：中药组（三物白散+空白对照组）、中药+LV-RNAi组、中药+ Survivin-RNAi-LV组，接种各组细胞到96孔板，每孔1×104个/100 μL，各组设置3个复孔。3组分别加入不同浓度同体积的中药三物白散（3.5、7.0、14.0 mg/mL）200 μL/孔。48 h后，每孔加入MTT试剂约20 μL，浓度5 mg/mL，继续恒温孵箱孵育4 h，弃培养液，加入二甲基亚砜（DMSO），每孔加150 μL，低速震荡10 min。全自动酶标仪测波长490 nm处每孔吸光值（A值）。抑制率以（1-A实验孔均值/A对照组均值）×100%表示。计算3个复孔的平均值。6）流式细胞仪检测三物白散对Survivin基因沉默转染后胃癌SGC-7901细胞凋亡率的影响。实验设3组：中药组（三物白散+空白对照组）、中药+LV-RNAi组、中药+Survivin-RNAi-LV组，接种到6孔板，每孔接种5×104个/200 μL，每组设3个复孔。每组分别加入不同浓度同体积的中药三物白散（3.5、7.0、14.0 mg/mL）200 μL/孔。37℃培养48 h，胰酶消化各组细胞，收集于EP管中，PBS液洗涤3次，然后离心，收集弃上清后的细胞，采用Annexin VFITC/PI法检测三物白散处理后胃癌细胞凋亡率。

1.5统计学处理应用SPSS17.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示。两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。多组间两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Survivin基因沉默Survivin mRNA表达的检测见图1。与空白对照组、阴性对照组相比，Survivin-RNAi-LV组条带明显变窄，Survivin-RNAi-LV组、阴性对照空载体慢病毒颗粒组和空白对照组Survivin mRNA的表达量分别为（0.15±0.04）、（1.02±0.09）、（1.08±0.14），Survivin-RNAi-LV组mRNA的表达量分别为阴性对照LV-RNAi组和空白对照组的14.71%和13.89%，干扰效率分别为85.29%和86.11%，差异有统计学意义（P＜0.05），而阴性对照LV-RNAi组和空白对照组的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结果发现含Survivin基因沉默重组慢病毒转染SGC-7901能有效降低内源性Survivin mRNA的表达。

2.2慢病毒颗粒转染人胃癌SGC-7901细胞Survivin蛋白的表达见图2。Western blot检测慢病毒颗粒转染人胃癌SGC-7901细胞Survivin蛋白的表达，与空白对照组（培养基）、阴性对照LV-RNAi组（空载体慢病毒颗粒2.5×109TU/mL）相比，Survivin-RNAi-LV组蛋白条带减弱，Survivin-RNAi-LV组Survivin蛋白的表达量（0.21±0.08）低于空白对照组（0.69±0.06）和阴性对照LV-RNAi组（0.71±0.04），Survivin-RNAi-LV组Survivin蛋白表达量下降了69.57%和70.42%，阴性对照LV-RNAi组和空白对照组的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结果发现含Survivin基因重组慢病毒转染SGC-7901能有效降低内源性Survivin蛋白的表达。

图1　Survivin基因沉默Survivin mRNA表达的检测

图2　慢病毒颗粒转染人胃癌SGC-7901细胞Survivin蛋白的表达

2.3MTT比色法检测Survivin基因沉默后对三物白散敏感度的影响见表1。MTT法检测Survivin基因沉默转染胃癌SGC-7901细胞后用三物白散处理，观察各组细胞的抑制率，观察发现，中药+Survivin-RNAi-LV组能明显抑制胃癌细胞增殖，抑制率明显高于中药组和中药+LV-RNAi组，且随着三物白散浓度的不同抑制率逐渐升高，提示Survivin基因沉默转染后能增强对三物白散的敏感性，且与药物浓度呈正相关性，而中药组和中药+LV-RNAi组两组的细胞抑制率无明显差异。

表1　MTT法检测转染后三物白散对细胞的抑制率（%，±s）

表1　MTT法检测转染后三物白散对细胞的抑制率（%，±s）

与中药组、中药+LV-RNAi组比较，*P＜0.05。下同。

药物浓度（mg/mL）n中药+Survivin-RNAi-LV组中药组中药+LV-RNAi组3.5350.46±3.14*7.0378.52±2.67*29.18±3.5930.95±2.07 41.36±3.4843.07±3.05 14.0389.31±4.35*48.53±4.2349.72±3.89

2.4流式细胞仪检测各组细胞的凋亡见图3，表2。流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，慢病毒介导的Survivin基因沉默组的细胞凋亡率明显高于单用中药未转染组和空载体转染组，且随着三物白散浓度的增高，其凋亡率亦升高，表明三物白散对Survivin基因沉默后胃癌细胞的凋亡具有明显的促进作用。

图3　各组细胞凋亡率检测结果

表2　流式细胞仪检测各组细胞凋亡率（%，±s）

表2　流式细胞仪检测各组细胞凋亡率（%，±s）

药物浓度（mg/mL）n中药+Survivin-RNAi-LV组中药组中药+LV-RNAi组3.5314.7±1.2*7.0320.1±2.6*2.3±0.92.5±0.4 4.7±0.64.6±0.8 14.0327.9±1.7*7.2±1.17.4±0.5

3　讨论

中医学认为，胃癌归属于“胃脘痛”“噎嗝”“癥瘕”“积聚”等范畴，病因病机主要有气滞、食积、痰瘀、毒聚、正虚等方面。中医在治疗该病方面有上千年的历史，中药已被肯定具有较好的治疗效果且毒副作用较小，中医辨证诊治有利于提高患者的生存质量和延长患者的生命［11］。经方三物白散是出自张仲景的《伤寒论·太阳病脉证并治》篇的方剂，由贝母、巴豆和桔梗含为一方，方中贝母化痰散结，《本草正义》言“象贝母蓄寒泄降，而能散结”。巴豆性热味辛并有毒，《神农本草经》谓其“破瘾瘕结聚坚积，留饮痰癖，大腹水肿。荡练五脏六腑，开通闭塞，利水谷道。去恶肉”。桔梗开肺提气，既可祛痰散结开肺，又可行药力于上，现代药理研究认为其有增强人体抵抗力的作用；三药共用，共达温下逐瘀、散寒除实、涤痰破结之功。前期我们使用经方三物白散加味治疗胃癌收到了较好的疗效［3］，且初步进行了研究，发现三物白散治疗胃癌的机制与Survivin基因有关［12-13］。

Survivin是凋亡抑制蛋白（IPA）家族中最受重视的新成员，是迄今为止发现的最强大的凋亡抑制因子，对细胞存活至关重要，故又成为生存素、存活素。在正常细胞内，Survivin的表达受到严格的控制，而在胃肠癌、肺癌、乳腺癌等癌细胞中，Survivin呈高表达［14］。已有多项研究检测胃癌组织中Survivin基因的表达，以探讨Survivin基因表达与胃癌的相关性。Da等［15］采用免疫组化方法分别检测正常胃黏膜、肠化生黏膜、不典型增生胃黏膜、胃癌组织中YAP蛋白和Survivin基因的表达，结果发现，Survivin基因在胃癌组织中表达呈强阳性。

近几年来随着科技的发展，RNA干扰（RNAi）技术、基因沉默抗癌症的研究也不断地增加。RNAi技术对于特定基因的表达，可以特异性地剔除或关闭。慢病毒（Lentivirus）载体技术，无论细胞是否处于分裂期，均可将外源基因或外源的shRNA有效地转染到宿主染色体上，从而达到持久稳定的沉默效应，具有高特异性、高效性、高稳定性和低毒性、无病毒蛋白表达［16］的优势，促进了基因组学的发展。

本研究采用通过Survivin-RNAi-LV转染人胃癌SGC-7901细胞，分为实验组（含Survivin基因沉默的慢病毒颗粒组）、阴性对照组（空载体转染组）、空白对照组（未转染组）3组，检测到Survivin mRNA和Survivin蛋白在Survivin-RNAi-LV组细胞中的表达水平较另2组明显下降，而空白对照组和阴性对照LVRNAi组中的表达差异无统计学意义，说明重组慢病毒颗粒转染细胞可以有效沉默Survivin，证实含Survivin基因沉默的重组慢病毒转染细胞株构建成功。构建转染细胞株后进行了后续三物白散对转染后胃癌细胞增殖及凋亡的影响实验，分为中药组、中药+LVRNAi组、中药+Survivin-RNAi-LV组6组，发现中药+ Survivin-RNAi-LV组三物白散对细胞的杀伤作用高于中药+LV-RNAi组和中药组，且随着药物浓度的增高，其杀伤作用亦增强。

综上所述，含Survivin基因沉默慢病毒颗粒转染人胃癌SGC-7901细胞，可以降低Survivin基因和蛋白的表达，再以不同浓度的三物白散处理，癌细胞增殖抑制率及凋亡率与药物浓度呈正比；提示三物白散对于Survivin基因沉默转染胃癌细胞具有较强的杀伤力，而对于普通胃癌细胞的杀伤力较弱；提示我们可通过基因沉默的方法来增强中药对于肿瘤的治疗作用，但其具体作用机制尚不明确，需要课题组进一步研究。

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The Effect of Sanwubai Powder on Gastric SGC-7901 Cells Transfected by Survivin-RNA gene Silencing

WANG Yipei，ZHU Ying.
The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410005，China

Objective：To observe the effect of Sanwubai Powder on human gastric cancer SGC-7901 cells containing survivin（Survivin）gene silencing transfected by Lentiviral Particles（Survivin-RNAi-LV）.Methods：The methods of RT-PCR and Western blot were used to detecte the expression of survivin gene mRNA and survivin protein.The method of MTT was used to detect the proliferation of SGC-7901 cells，and the flow cytometry was uesed to test the apoptosis rate and the effects of Sanwubai powder on proliferation inhibition rate and apoptosis rate.Results：Recombinant lentiviral particle-mediated Survivin gene silencing transfecting human gastric cancer SGC-7901 cells could effectively silence the expression of Survivin mRNA and protein.Sanwubai Powder could inhibit the growth and induce apoptosis of human gastric cancer SGC-7901 cells.The cell proliferation in Survivin gene silencing transfecting into gastric cancer SGC-7901 cells group using Sanwubai Powder was weaker than Sanwubai Powder+blank control group and San Wu Bai San+negative control group（P＜0.05），while apoptosis rate was higher than.Conclusion：Recombinant Lentiviral Particles transfecting human gastric cancer SGC-7901 cells，containing Survivin gene silencing，can inhibit the expression of Survivin mRNA and protein in SGC-7901 cells.The lethality of Sanwubai Powder on gastric cancer cells in the group of Survivin gene silencing transfection has more significantly improved than that in the non-transfected cells.

Sanwubai Powder；Survivin gene silencing；Gastric cancer；SGC-7901 cell；Effect

R730.59

A

1004-745X（2015）10-1758-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.022

2015-04-15）

湖南中医药大学青年基金资助项目

（电子邮箱：zhuying089@126.com）