活血祛风法对咳嗽变异性哮喘模型大鼠肺组织Caspase3的影响*

张晶洁徐荣谦孙洮玉倪玉婷朱洧仪

（1.北京市昌平区中西医结合医院，北京102208；2.北京中医药大学东直门医院，北京100700）

·研究报告·

活血祛风法对咳嗽变异性哮喘模型大鼠肺组织Caspase3的影响*

张晶洁1徐荣谦2△孙洮玉2倪玉婷2朱洧仪2

（1.北京市昌平区中西医结合医院，北京102208；2.北京中医药大学东直门医院，北京100700）

目的观察活血祛风法对咳嗽变异性哮喘（CVA）模型大鼠肺组织半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）的影响。方法将Wistar大鼠48只按随机数字表法分为模型组、正常组、西药组、中药高、中、低剂量组6组，每组8只。采用卵蛋白与氢氧化铝溶液注射、雾化等综合方法复制CVA大鼠模型，造模成功后各用药组分别给予中药及西药进行干预，正常组及模型组给予羧甲基纤维素钠（CMC）干预，治疗4周后处死大鼠，进行取材。各组大鼠HE染色观察气道病理改变，免疫组织化学法检测各组大鼠肺组织内Caspase3表达水平。结果模型组肺组织炎症、水肿程度较正常组明显加重；与模型组相比，各用药组则均有改善。模型组大鼠Caspase3在肺中表达明显高于正常组（P＜0.05），而西药组，中药高、中、低剂量组Caspase3的表达则明显低于模型组（P＜0.05）。结论以活血祛风法立法的加味芎蝎散可缓解CVA大鼠肺组织炎症以及降低其肺组织内Caspase3的表达，起到抑制气道上皮细胞凋亡来减少气道上皮损伤，可能是加味芎蝎散作用机制之一。

活血祛风法咳嗽变异性哮喘细胞凋亡Caspase3

咳嗽变异性哮喘（CVA）临床主要表现为刺激性的干咳，很少出现喘息和呼吸困难；大多数患儿有个人或家族过敏史；临床无感染征象，或经长时间抗生素治疗无效；肺功能检测以及查体常常无异常；支气管扩张剂可使病情得到缓解［1］。由于本病具有独特的临床表现“只咳不喘”，并且许多儿科医生对本病认识不足，极易造成误诊、漏诊。有报道指出本病的误诊率可达82.5%［2］；儿童时期的CVA是发展为典型哮喘的一个危险因素［3］。近年来，中医药治疗儿童CVA取得了较好的临床疗效，并且进行了更加深入的临床研究。但是，目前研究中医药治疗CVA也存在一些问题，尤其在探讨作用机制方面研究相对较少。本研究采用以活血祛风立法的加味芎蝎散为干预手段，与西药顺尔宁进行对比研究，观察其对CVA模型大鼠肺组织半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）表达的影响，探讨其治疗CVA的作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级健康雄性Wistar大鼠，体质量90～100 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXX（京）2006-0009。

1.2试剂与药品1）试剂。卵清蛋白（OVA），Sigma公司生产，批号A5378。氢氧化铝，上海美兴化工股份有限公司生产，批号100801。大鼠Caspase3兔多克隆抗体，购于北京博奥森生物技术有限公司。兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒、浓缩型DAB试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。2）药品。加味芎蝎散配方颗粒主要药物组成：川芎10 g，全蝎5 g，荜茇1 g，细辛1 g，清半夏6 g，桃仁10 g，当归10 g，白前10 g，五味子10 g，芦根15 g（东直门医院制剂室提供）。孟鲁司特钠片（顺尔宁），杭州默沙东制药有限公司，批号100487。

1.3模型制备参照文献［4］进行造模。除正常组外，余下各组大鼠，第1日肌注4%OVA溶液0.5mL，同时腹腔注射2%Al（OH）30.2mL。第15日，用1%OVA溶液进行雾化，隔日1次，共7次。

1.4分组及给药将48只大鼠按随机数字表法分为6组，包括模型组、西药组、中药高、中、低剂量组，每组8只，均予以造模；正常组8只，不予以造模。但与其余各组同步饲养观察。造模后，正常组、模型组予以0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）灌胃。西药以及中药配方颗粒于实验前用0.5%CMC配制成溶液。西药组予以顺尔宁混悬液按1.3 mg/（kg·d）灌胃；中药高、中、低剂量组予以中药混悬液按照［5.47、2.74、1.37 g/（kg·d）］剂量灌胃。每日1次，连续4周。给药容量均为1 mL（100 g·d）。

1.5观察项目1）肺组织病理改变观察。给药4周后，各组大鼠以10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）腹腔麻醉。剪取大鼠右上叶肺组织置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片。HE染色，显微镜下观察病理改变。2）肺组织Caspase3表达测定。采用兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒测定大鼠右上叶肺组织Caspase3的表达。按照试剂盒说明书操作。采用日本OLYMPUS显微镜采集图像，每张切片在高倍镜下（400倍）至少选取3个不重叠视野。然后用Image-Pro Plus软件对图像进行分析，计算出阳性表达面积占待测总面积的百分比，取平均值，得出该动物肺组织中Caspase3值。1.6统计学处理应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组肺组织病理变化见图1。正常组大鼠肺组织偶见炎性细胞浸润，管腔通畅，管壁结构完整无破坏，黏膜无充血及水肿。与正常组比较，模型组大鼠肺组织有大量炎性细胞浸润，淋巴组织增生，支气管壁及肺泡隔均增厚、水肿，肺泡腔内有脱落的上皮细胞。与模型组比较，西药组、中药各剂量组炎性细胞浸润明显减少，水肿程度减轻。中药各剂量组与西药组比较病理变化无明显差异。

图1　各组肺组织病理变化（HE染色，×400）

2.2各组肺组织Caspase3的测定见表1。模型组肺组织中Caspase3表达升高，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药各剂量组、西药组肺组织中Caspase3表达降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3　讨论

CVA被认为是有喘息和呼吸困难症状的典型哮喘的变异形式。目前CVA的发病机制尚不十分清楚，多数学者认为CVA也是一种气道慢性炎症性疾病，并且是典型哮喘的前期阶段，其发病机制、病理改变也与典型哮喘非常相似，只是严重程度不同［5-6］。

The Effect of Promoting Blood Circulation and Expelling Wind on Lung Tissue Caspase3 in Rats with CVA

ZHANG Jingjie，XU Rongqian，SUN Taoyu，et al.

Changping Hospital of Integrated TCM&WM，Beijing 102208，China

Objective：To explore the effect of promoting blood circulation and expelling wind on lung tissue Caspase3 in Rats with CVA.Methods：Forty eight Wistar rats were randomly divided into six groups（n＝8）：the model group，the control group，the western medicine group，and the herbal medicine groups with high，medium and low doses.The rats were injected and inhaled with OVA and aluminum hydroxide solution to make CVA model rats.Then the western medicine group and the herbal medicine groups with high，medium and low doses were intervened by western medicine and herbal medicine；the control group and model group were given CMC for four weeks.After the rats were killed，lung tissue was drawn from rats with CVA.Pathological changes of airway of rats were observed with HE.Caspase3 expression in lung tissue was investigated by means of immunohistochemical method.Results：The inflammation edemas of lung tissue increased in the model group.Compared with the model group，there was significant difference between the treatment group and the control group.The Caspase3 expression increased in lung tissue in the model group，compared with the control group.Compared with the model group，the results indicated that Caspase3 expression level decreased in the western medicine group and the herbal medicine groups with high，medium and low doses（all P＜0.05）.Conclusion：Jiawei Xiongxie San by promoting blood circulation and expelling wind can relieve inflammation and reduce expression of Caspase3 in lung tissue of the CVA model rats，reducing epithelial injury of airway by inhibiting airway epithelial cell apoptosis，which may be one of the important mechanisms for treatment of CVA.

Promoting blood circulation and expelling wind method；Cough variant asthma；Apoptosis；Caspase3

R285.5

A

1004-745X（2015）10-1708-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.006

高等学校博士学科点专项科研基金（20100013110013）；北京市中医药科技发展资金项目（QN2013-20）

（电子邮箱：xurongqian1950@163.com）