胰泰复方对慢性胰腺炎胰腺纤维化大鼠Bcl-x和p53表达的影响*

王科军高丽娟张淼刘华生△

（1.黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040）

·研究报告·

胰泰复方对慢性胰腺炎胰腺纤维化大鼠Bcl-x和p53表达的影响*

王科军1高丽娟2张淼1刘华生1△

（1.黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040）

目的观察胰泰复方对慢性胰腺炎胰腺纤维化大鼠Bcl-x和p53表达的影响。方法将大鼠分成4组，空白组、模型组、中药对照组、中药治疗组。空白组腹腔注射0.9%氯化钠注射液；其余各组腹腔注射L-精氨酸，制备慢性胰腺炎大鼠模型。造模成功，各组实行相应治疗2个月。治疗结束后，采用免疫组织化学法检测各组大鼠胰腺组织的Bcl-x和p53蛋白表达。结果模型组、中药对照组和中药治疗组中的Bcl-x蛋白表达水平显著低于空白组；中药治疗组中的Bcl-x蛋白表达水平高于中药对照组和模型组；模型组、中药对照组和中药治疗组中的p53蛋白表达水平显著高于空白组；中药治疗组中的p53蛋白表达水平低于中药对照组和模型组（均P＜0.05或P＜0.01）。结论胰泰复方可以减缓慢性胰腺炎胰腺纤维化进程，其分子机制可能与Bcl-x蛋白表达上调及p53蛋白表达下调相关。

慢性胰腺炎胰腺纤维化胰泰复方Bcl-xp53

随着现代人生活饮食方式的转变，慢性胰腺炎（CP）的发病有呈逐年升高的趋势，但尚未有明确的流行病学资料。CP是各种致病因素导致胰腺组织及其功能不可逆转改变的一种慢性炎症性疾病［1］，胰腺实质的纤维化表现是其主要的病理学特征［2］。细胞凋亡与组织纤维化的发生发展有着密切的关系，很多学者研究亦集中于此。如曹勤等［3］研究发现甘草酸可能通过下调细胞凋亡相关基因p53蛋白表达水平而发挥其抗肝纤维化的作用。本课题组长期从事胰腺纤维化的研究，亦得出CP胰腺纤维化与细胞凋亡具有相关性［4］。基于此，笔者欲通过检测胰泰复方对慢性胰腺炎胰腺纤维化大鼠Bcl-x和p53表达的影响，进一步探讨胰腺纤维化与细胞凋亡的关系及胰泰复方抑制胰腺纤维化的作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物SD雄性大鼠40只，体质量（250±20）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心供给。

1.2药剂与仪器胰泰复方由柴胡、白术、人参、红花、桃仁、当归等组成，于黑龙江中医药大学第一附属医院购买；清胰利胆颗粒是由吉林省长春银诺克药业有限公司生产制造，于哈尔滨哈恒瑞新特药店购买；L-精氨酸来源于天津博迪化工有限公司；Bcl-x免疫组化染色试剂盒来源于北京中杉金桥生物技术有限公司；p53免疫组化染色试剂盒来源于北京中杉金桥生物技术有限公司。主要仪器有：日本生产的Olympus B×60研究用显微镜、德国生产的Thermo HM 340E石蜡切片机、中国厦门麦克奥迪提供的Motic Med 6.0数码医学图像分析系统。

1.3模型制备应用0.9%氯化钠注射液配置成13.3%的L-精氨酸溶液，模型组、中药对照组及中药治疗组实行左下腹腔注射13.3%L-精氨酸，制备CP大鼠实验模型。每次给药时，分2次实行左下腹腔注射，时间间隔为1 h，每次所需L-精氨酸的量按照大鼠每100 g质量需用药0.2 g进行计算。L-精氨酸给药总计3次，时间间隔为3 d，共10 d完成。空白组应用0.9%氯化钠注射液实行左腹腔注射，用量、次数及方法与前相同。

1.4分组与方法40只SD大鼠随机分为空白组、模型组、中药对照组及中药治疗组，共4组，每组各包含10只。造模成功后，于第11日，各组开始行相应药物灌胃治疗，中药治疗组应用胰泰复方水煎剂治疗，依照11.25 g/kg标准进行灌胃，中药对照组给予清胰利胆颗粒冲剂，依照2.7 g/kg标准进行灌胃（以上计算标准应用正常成人与大鼠给药剂量系数折算得出），模型组、空白组给予相应量的0.9%氯化钠注射液进行灌胃。以上治疗，每日1次，持续给药2个月。

1.5标本采集与检测灌胃治疗结束后，处死各组实验大鼠，行开腹解剖，摘取其相同部位的胰腺组织后，立即浸入10%中性甲醛缓冲液中固定24 h以上。先用梯度酒精脱水、二甲苯透明，然后进行石蜡包埋，切片厚度约为3 μm，最后施行免疫组化检测。Bcl-x和p53蛋白表达检测，应用即用型一步法免疫组化测定法，Bcl-x和p53试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，依照说明书进行实验操作。首先将组织切片脱蜡并水化。然后依据Bcl-x或p53一抗的需要，应用pH为6.0的抗原修复液对组织切片进行预处置。随后用3%H2O2去离子水孵育切片，持续15 min，用以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗，滴加Bcl-x或p53一抗，4℃孵育留宿；PBS浸洗，滴加IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，37℃孵育30 min，PBS每次冲洗3 min，共5次；使用DAB溶液染色，镜下控制染色结果。最后依次进行蒸馏水冲洗、苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、树脂封片。将切片置在200倍显微境下观察并拍摄照片，采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对各组切片进行分析，得到各组切片的阳性目标面密度，以此来判定Bcl-x和p53蛋白表达结果。Bcl-x表达为细胞浆和细胞膜，p53表达为细胞核，各组切片中阳性表达为棕黄色沉积。

1.6统计学处理使用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，运用单因素方差分析的方法对多样本均数进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

各组大鼠胰腺组织Bcl-x与P53表达水平比较见表1和图1，图2。模型组、中药对照组和中药治疗组中的Bcl-x蛋白表达水平显著低于空白组（P＜0.01）；中药治疗组中的Bcl-x蛋白表达水平高于中药对照组（P＜0.05），且显著高于模型组（P＜0.01）；模型组、中药对照组和中药治疗组中的p53蛋白表达水平显著高于空白组（P＜0.01）；中药治疗组中的p53蛋白表达水平低于中药对照组（P＜0.05），且显著低于模型组（P＜0.01）。

表1　各组大鼠BCL-x和p53蛋白表达结果比较（±s）

表1　各组大鼠BCL-x和p53蛋白表达结果比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与中药对照组比较，#P＜0.05。

组别nBCL-xp53空白组100.07763±0.010930.00191±0.00098模型组100.01904±0.00331*0.06026±0.01795*中药对照组100.03157±0.00576*△0.03932±0.00901*△中药治疗组100.04160±0.00273*△#0.02293±0.00904*△#

3　讨论

导致胰腺纤维化的因素较为广泛，其具体发病机制仍尚未明确［5］，但过多分泌的细胞外基质（ECM）和大量的成纤维细胞增生是其主要的病理学基础。腺泡逐渐萎缩丢失被纤维增生所替代是CP腺纤维化的前提。胰腺腺泡的坏死及凋亡与与腺泡的萎缩丢失有着密切的关系，而且胰腺腺泡细胞凋亡的现象在人或大鼠CP组织中都有发生。因此，细胞凋亡在胰腺纤维化的发展进程中具有着重要的意义。细胞凋亡是细胞本身主动进行死亡的生物学过程，在多种基因调控下而发生。其中Bcl-2蛋白家族和抑癌基因p53对细胞凋亡有重要的调控作用。Bcl-2基因家族主要由Bcl-2、Bcl-x及Bax等组成。Bcl-x主要由Bcl-xl和Bcl-xs两型组成，其中以Bcl-xl的作用为主，对线粒体通透性转换孔（PTP）开放具有抑制的作用，从而起到抑制细胞凋亡的作用［6］。p53可分为野生型p53和突变型p53两种类型。野生型p53对人体细胞的转化生长具有较大的调控作用，具有诱导发生细胞凋亡的作用，而突变型p53可以诱导发生多种癌变。本实验通过对胰腺组织中的Bcl-x及p53蛋白表达的检测，可推断胰泰复方可能通过调控与细胞凋亡相关因子Bcl-x和p53的表达而发挥作用，对胰腺纤维化的发展进程具有较大的调控作用，为探讨研究中医药治疗CP纤维化的机制提供了实验依据。

图1　各组BCL-x表达（HE，×20）

图2　各组p53表达（HE，×20）

CP典型的症状表现为发作性上腹部疼痛，后期可逐渐出现食欲降低、食少、纳呆、便溏及消瘦。因此症状上来看，多与中医学的腹痛和泄泻等疾病相关。中医之脾为后天之本，主运化，是气血产生的源头；西医之胰为消化腺，具有分泌含有丰富消化液的胰液的作用。因此，从中医之病位上来分析，多与脾胃相关，从中医之病机上来分析，多为虚实夹杂，以脾虚为本，气滞血瘀为标。因此，中医在治疗CP时，应标本兼治，以治疗脾虚为中心，兼以疏肝行气，活血化瘀。胰泰复方就是建立在这样的治疗原则基础上而形成的，在临床中应用效果显著。针对CP的中医脾虚病机本质，方中选用具有健脾益气功效的人参、白术和茯苓为君药，主要用来恢复脾的正常生理功能；针对气滞血瘀的实性病机，选用具有疏肝活血止痛功效的柴胡、桃仁和当归为臣药，以达行气活血而止疼痛的目的；最后，使以甘草，以达补气而调和诸药的目的。纵观全方，可知胰泰复方是由四君子汤与复元活血汤化裁而成，具有健脾益气、行气活血的功用。

［1］中华医学会外科学分会胰腺外科学组.慢性胰腺炎诊治指南（2014）［J］.临床肝胆病杂志，2015，31（3）：322.

［2］Stevens T，Conwell DL，Zuccaro G.Pathogenesis of chronic pancreatitis：an evidence-based review of past theories and recent developments［J］.Am J Gastroenterol，2004，99（11）：2256-2270.

［3］曹勤，蔡瑜，郭晓玲，等.甘草酸对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化肝组织p53蛋白表达的影响［J］.中华消化病与影像杂志：电子版，2014，4（6）：10-13.

［4］刘华生，刘爽，周景华.胰泰复方对慢性胰腺炎胰腺纤维化大鼠凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响［J］.中国中医急症，2008，17（5）：662-663.

［5］Braganza JM，Lee SH，McCloy RF，et al.Chronic pancreatitis［J］.Lancet，2011，377（9712）：1184-1197.

［6］施勤，刘继明，张学光.细胞凋亡的线粒体调控与BCL-2基因家族［J］.上海免疫学杂志，2000，20（1）：60-61.

Effects of Yintai Compounded Medication on the Expression of Bcl-x and P53 in the Chronic Pancreatitis Rats with Pancreatic Fibrosis

WANG Kejun，GAO Lijuan，ZHANG Miao，et al.

Department of TCM diagnostics in basic medical college of Heilongjiang University of TCM，Heilongjiang，Harbin 150040，China

Objective：To research the effects of Yintai Compounded Medication on the expression of Bcl-x and P53 in the chronic pancreatitis rats with pancreatic fibrosis and discuss its mechanism of the effects.Methods：40 SD rats were divided into 4 groups：the normal group，the model group（treated with normal saline），Chinese Medicine control group（treated with Qingyilidan Granula）and Chinese Medicine treatment group（treated with Yintai Compounded Medication）.The normal group received celiac injection of normal saline，while the other groups were treated with celiac injection of 13.3%L-arginine for establishing chronic pancreatitis rat models.And then the four groups were given corresponding treatment.After 2-month treatment，we used immunohistochemical method to detect the expression of Bcl-x and P53.Results：The expression levels of Bcl-x in the model group，Chinese Medicine control group and Chinese Medicine treatment group were significantly lower than that of the normal group（P＜0.01）；the expression level of Bcl-x in Chinese Medicine treatment group was higher than that of Chinese Medicine control group（P＜0.05），and significantly higher than that of the model group（P＜0.01）.The expression levels of P53 in the model group，Chinese Medicine control group and Chinese Medicine treatment group were significantly higher than that of the normal group（P＜0.01）；the expression level of P53 in Chinese Medicine treatment group was lower than that of Chinese Medicine control group（P＜0.05），and significantly lower than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion：Yintai Compounded Medication can slow down the process of pancreatic fibrosis，which is possibly related with the up-regulation of Bcl-x and the down-regulation of P53.

Chronic pancreatitis；Pancreatic fibrosis；Yintai Compounded Medication；Bcl-x；P53

R285.5

A

1004-745X（2015）10-1705-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.005

2015-06-21）

黑龙江省自然科学基金资助项目（D2005-37）；教育部“春晖计划”合作科研资助项目（404S809）；黑龙江中医药大学校科研基金资助项目（2014bs08）

（电子邮箱：741835240@qq.com）