抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

陈伯祥，杨 明，贺泂杰，李 杰

（1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050）

抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

陈伯祥1，杨 明1，贺泂杰2，李 杰1

（1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉 744000；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050）

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒P32蛋白为免疫原，构建杂交瘤细胞株，制备P32蛋白单克隆抗体。用纯化的P32蛋白免疫BALB/C小鼠后，按常规方法进行细胞融合，构建抗山羊痘病毒P32蛋白的杂交瘤细胞，制备P32蛋白单克隆抗体，获得4株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株，腹水抗体效价均在105以上。山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备为进一步开展检测方法研究提供了材料。

山羊痘病毒；P32蛋白；杂交瘤细胞；单克隆抗体

山羊痘是由山羊痘病毒（goat poxvirus，GTPV）引起的一种急性、热性、接触性传染病，病羊以发热、全身起痘、呼吸道和消化道损伤以及淋巴结肿大为特征。近年来，山羊痘在我国陕西、甘肃、四川、贵州、云南、内蒙古、福建、江苏等省（自治区）均有发生和流行的报道，对当地养羊业造成巨大的经济损失。

山羊痘病毒基因组大小为143 kb～147 kb，共有147个开放阅读框（ORF），编码密度为93%，所编码的蛋白质含53～2027个氨基酸不等。P32具有抗原特异性，P32是含有一个抗原决定簇，由319～324个氨基酸组成的囊膜蛋白，羧基端有一个跨膜结构域，对细胞有毒害作用。山羊痘病毒P32的结构蛋白，具有免疫原性，免疫羊等动物后可产生具有保护性的抗体，虽不能阻止病毒在攻毒部位的增殖，但可以阻止病毒向其他部位扩散，减轻病羊的病理变化，可降低死亡率。国内外学者还发现山羊痘病毒、绵羊痘病毒在P32基因上核苷酸和氨基酸水平上高度的同源，分别为97.5%和94.7%，两者差异在绵羊痘病毒P32基因序列中第55位氨基酸是天冬氨酸，而山羊痘病毒中此位无此氨基酸。

目前，山羊痘的诊断主要依靠临床经验来判断，国内缺乏高效准确的山羊痘病毒的检测方法。为此，本研究用表达了山羊痘病毒P32蛋白作免疫抗原，构建抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞，制备单克隆抗体，为进一步建立山羊痘的检测方法奠定工作基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1毒株与菌株。山羊痘毒株（GTPV-S-1）、羊口疮病毒株、鸽新城疫病毒株、鸡减蛋综合症病毒株、S.enteritidis和E.coli由甘肃省畜牧兽医研究所保存 ；山羊痘病毒P32蛋白抗原由本课题组提供。

1.1.2细胞株和实验动物。SP2/0细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；BALB/C小鼠（18～20g、6～8周龄、雌性），购自卫生部兰州生物制品研究所小动物室。

1.1.3主要试剂。新生牛血清（杭州四季青）；RPMI1640（GIBCO）；HAT、HT、次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷、 氨基喋呤、8-氮鸟嘌呤、羊抗小鼠IGg-HRP（Solarbio）；PEG1500（Merck）；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（Sigma）。

1.2方法

1.2.1抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞的构建

1.2.1.1小白鼠免疫。将纯化的山羊痘病毒P32重组蛋白与弗氏佐剂等比例混合、乳化，分别免疫6～8周龄雌性BALB/C小白鼠6只。首免以弗氏完全佐剂乳化抗原，腹腔注射50 μg/只（0.2 mL）；二免，间隔15 d，用弗氏不完全佐剂乳化抗原免疫，腹腔注射50 μg/只（0.2 mL）；三免，间隔时间15 d，不加佐剂的P32重组蛋白作为免疫原，背部皮下分6点注射，每只100 μg（0.2 mL）；同时，从尾部尾静脉采血，用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体水平。小鼠血清效价达到1:4 000以上，该小鼠的脾细胞可作用于细胞融合。三免后第3 d可进行细胞融合。

1.2.1.2细胞融合。按常规方法，对免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，且小鼠脾细胞与SP2/0细胞的数量比为5：1。融合后的细胞分装于含饲养细胞的培养孔中，置37 ℃5%CO2培养。每日观察每孔的细胞生长情况，并作好记录。在融合后6～7 d，每孔移去HAT培养液0.1 mL，补加等量的HT培养液，继续培养。

1.2.1.3筛选和克隆阳性杂交瘤细胞。待融合后的细胞生长到覆盖细胞孔底部1/4～1/3时，细胞生长良好时，用间接ELISA方法检测上清液中的抗体。同时设阴、阳性对照，阳性对照孔为免疫小鼠血清，阴性对照为SP2/0细胞上清和阴性小鼠血清，P/N≥2.0时判为阳性。经2次检测为阳性的杂交瘤细胞孔按有限稀释法进行克隆化培养。选择OD492值高、细胞活力好的细胞孔进行扩大培养，及时冻存。

1.2.2抗山羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体制备及鉴定。取10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射0.5 mL灭菌液体石蜡油进行预处理。7 d后，小鼠腹腔注射生长良好杂交瘤细胞，0.75×106个/只，收集腹水，测定抗体效价，分装后置-80℃保存。特异性检测：用间接ELISA方法测定与山羊痘病毒、羊口疮病毒、鸽新城疫病毒、鸡产蛋下降综合征病毒、S.enteritidis和E.coli交叉反应性。

2　结果

2.1细胞融合与克隆

免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用化学融合剂PEG 1500进行细胞融合。经不断改进融合技术，细胞融合率达到90%以上，阳性率为10%。将第1 次检测到的10株阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法克隆3次，经检测和筛选最终获得4株能够稳定分泌抗GTPV-P32蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞（1C9、1B11、3C8、3G9），随着克隆代次增加，细胞培养上清液中抗体OD492值逐步升高，到第3次克隆时最终达到稳定。

2.2单克隆抗体腹水的制备及抗体效价

灭菌液体石蜡油处理BALB/C小鼠，1周后分别接种4株阳性杂交瘤细胞，待小鼠腹部膨大，用注射器无菌抽取腹水，以3 000 r/min离心20 min，收集上清，测定抗体效价，结果见表1。

表1　不同杂交瘤细胞株在腹水和细胞培养液效价的测定结果

由表1可知，杂交瘤细胞的腹水抗体效价在105以上，细胞培养液的效价为1:64。

2.3单抗特异性试验

用间接ELISA检测单抗与其它病毒的交叉反应，结果发现它只与山羊痘病毒P32重组蛋白呈阳性反应，而与羊口疮、鸽新城疫病毒、鸡产蛋下降综合征病毒、S.enteritidis、E.coli都不发生交叉反应，说明这4株单抗都是针对山羊痘病毒P32蛋白的，具有良好的特异性。

3　讨论

山羊痘病毒P32基因位于基因组的64 kb～65 kb处，由第74 ORF编码［1］，由319～324个氨基酸组成，含一个重要的抗原决定簇，具有跨膜结构，跨膜螺旋结构（TM）位于C端287～307位氨基酸处。P32全长基因对细胞有毒性作用，且在原核细胞中表达含量较低［2］。国内外学者试图对P32基因截去跨膜区进行表达，是否与完整的P32蛋白具有相同的抗原性和特异性。陈智华等人研究证实P32基因截去跨膜区后不影响其在哺乳动物细胞中的翻译转录，能刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答，从而说明截去跨膜区并未破坏P32蛋白抗原的决定簇［3］。我们所用的P32蛋白也是截去跨膜区后所表达的，经免疫小鼠后能产生免疫应答。这一点同陈智华等人的研究相符。

杂交瘤细胞构建环节多，稍不慎就前功尽弃，须细心对待每一环节。我们按常规方法构建出了10株抗山羊痘病毒P32蛋白的杂交瘤细胞株，经测试从中筛选出4株特异、能产生效价较高的抗体杂交瘤细胞株为山羊痘检测方法的建立创造了条件。

［1］Tulman E R，Afonso C L，Lu Z，et al. The genomes of sheep and goat pox viruses ［J］.Journal of virology，2002，76（12）：6054-6061.

［2］陈轶霞，郑亚东，窦永喜，等. 羊痘病毒P32蛋白基因的克隆与原核表达［J］.动物医学进展，2007，28（1）：31-34.

［3］陈智华，陈轶霞，刘俊林，等. 截去跨膜区对羊痘病毒P32基因免疫原性的影响［J］.中兽医医药杂志，2009，28（4）：30-32.

（责任编辑：胡藕祥）

Preparation of Monoclonal Antibodies against Goat Poxvirus P32 Protein

Chen Boxiang1，Yang Ming1，He Jiongjie2，Li Jie1
（1. Gansu Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Pingliang，Gansu 744000；2.Lanzhou Animal Husbandry and Veterinary Drug Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou，Gansu 730050）

The study was aimed to construct hybridoma cell line by using purified goat poxvirus P32 protein as immunogen for preparation of P32 protein monoclonal antibody. After BALB/C mice were immunized with purified P32 protein of goat poxvirus，cell fusion was carried out according to the routine method，resulting in 4 hybridoma cell lines，which could stably secrete P32 protein monoclonal antibody with good specificity. The ascites antibody titers were higher than 105. Construction of goat poxvirus P32 protein and preparation of monoclonal antibodies provided material for further research on the virus.

goat poxvirus；P32 protein；hybridoma cell；monoclonal antibody

S852.65+4

A

1005-944X（2015）12-0066-03

甘肃省科技支撑计划（1104NKCL097）