牛结核分枝杆菌株快速培养方法的对比

古努尔·吐尔逊，努尔拜合提，沙依兰·卡依扎，王俊伟，呼西旦·阿巴拜克力

（新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000）

牛结核分枝杆菌株快速培养方法的对比

古努尔·吐尔逊，努尔拜合提，沙依兰·卡依扎，王俊伟，呼西旦·阿巴拜克力

（新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000）

［目的］应用引进的Va间接培养方法、传统的丙酮酸钠、L-J培养基直接培养方法对牛结核分枝杆菌生长时间进行对比试验。［方法］将牛型结核分枝杆菌接种于含0.1%琼脂Va培养基中预培养24 h，转接到含0.3%琼脂Va培养基中培养6 d后分别转接到丙酮酸钠培养基和L-J培养基上（间接法）；同时牛型结核分枝杆菌接菌于丙酮酸钠培养基和L-J培养基培养，在37 ℃培养箱内孵育（直接方法），每天观察，并记录出现菌落时间。［结果］接种Va培养基的菌株分别转接丙酮酸钠培养基和L-J培养基后第3 d可见菌落，第12 d培养基斜面可见典型的牛型结核分枝杆菌菌落；而直接接种于丙酮酸钠培养基与L-J培养基后分别于第26 d和第31 d可见典型的牛型结核分枝杆菌菌落。［结论］引进的Va牛型结核分枝杆菌间接培养方法可以缩短菌落培养时间，为牛型结核杆菌病提供早期诊断依据。

丙酮酸钠培养基；L-J培养基；牛结核分枝杆菌株；Va培养基；早期诊断

牛结核病是主要由牛分枝杆菌和结核分枝杆菌引起的一种人畜共患慢性消耗性传染病。牛结核分枝杆菌是一种抗酸的杆菌，是结核分枝杆菌复合群，主要通过吸入传播。牛结核病的有效控制手段是及时和有效的诊断［1-2］。结核病细菌学的方法是实验室诊断的主要方法之一。常用的培养基有改良罗氏培养基（L-J培养基）和丙酮酸钠培养基［3-4］，虽然这两种培养基已有百年的历史［5］，但是这两种培养基培养时间长，需4～8周，达不到快速诊断的目的［6-8］。为了使牛结核分枝杆菌能快速培养，本实验引进了快速培养方法，即将牛结核分枝杆菌在Va培养基中先进行预培养后再用L-J培养基和丙酮酸钠培养基进行培养（间接法），并与直接培养在两种培养基（直接法）进行比较，初步证实了间接法能缩短培养时间。现报告如下：

1　材料

1.1实验材料

牛结核分枝杆菌标准菌株购于中国药品生物制品检定所菌苗室，本室保存。

1.2培养基

1.2.1Va培养基配方引进于哈萨克斯坦哈萨克科学兽医研究所结核病研究室，在本实验室制备。含0.1%琼脂Va培养基主要成份：KH2PO4，Na2HPO4，MgSO4，二水柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O），柠檬酸铁铵，L-天冬酰胺，甘油，琼脂粉；含0.3%琼脂Va培养基主要成份：除含200%糖外，其他成份同含0.1%琼Va培养基。

1.2.2自制丙酮酸钠培养基和L-J培养基。

2　方法

2.1直接法培养

牛结核分枝杆菌标准菌株在无菌环境下加生理盐水研磨稀释，分别接种于丙酮酸钠培养基、L-J培养基的斜面上0.2 ml菌液，每天观察细菌生成情况并记录。

2.2间接法培养

取无菌处理的牛结核分枝杆菌标准菌株0.2 ml加入到含0.1%琼脂的Va培养基内，使菌液与培养基充分混匀后，置37 ℃培养箱预孵育24 h后，再用无菌的玻璃吸管吸取0.2 ml的含培养基的菌液垂直穿刺到含0.3%琼脂的Va培养基，置37 ℃培养箱孵育6 d，再用吸管吸取穿刺培养的菌液到丙酮酸钠培养基和L-J培养基斜面上，置37 ℃培养箱培育，每天观察并记录。

3　结果

3.1直接法培养

牛型结核分枝杆菌标准菌株直接在丙酮酸钠和L-J培养基上均生长良好。培养后，在丙酮酸钠培养基上培养13 d可看到菌落长出，26 d 后长出典型的菌落；在L-J培养基上培养15 d可看到菌落长出，31 d后长出典型的菌落（表1）。

3.2间接培养方法

牛型结核分枝杆菌标准菌株接种于Va培养基预培养后，分别转接丙酮酸钠培养基和L-J培养基每天观察一次菌落生长及污染情况。接种后2 d在两种培养基上可以看到似有菌生长的迹象，3 d可看到菌落长出，预培养全过程需 10 d；12 d均已长出典型的菌落（表1、图1），预培养全过程需19 d。未出现培养污染。

表1　牛结核分枝杆菌标准菌株直接法和间接法培养结果比较

图1　牛结核分枝杆菌标准菌株用间接法培养

4　讨论

结核病的细菌学检测是结核病控制、流行病学调查以及临床诊断与鉴别诊断的“金标准”［9］，也是最直接的方法。结核分枝杆菌培养在结核病细菌学诊断方面具有决定性意义，而且提高阳性率［10］，因此细菌培养在某种程度上利于提高结核病的发现率。该方法是结核病确证最可靠的方法，也是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验，以及分子流行病学分析等其它生物学研究的基础［11］。但是牛结核分枝杆菌在传统的L-J培养基和丙酮酸钠培养基生长比较缓慢，营养要求高。本研究用传统的L-J培养基和丙酮酸钠培养基与引进的Va间接培养基进行比较培养可见，间接培养方法先预培养再转接L-J培养基和丙酮酸钠培养基第3 d出现可见菌落，预培养全过程需10 d，第12 d培养基斜面出现典型菌落，预培养全过程需19 d。而在直接接种丙酮酸钠培养基形成菌落所需要的天数是26 d；在L-J培养基形成菌落所需要的天数是31 d（会不会出现假阳性）。结果说明，在Va培养基进行预培养后，可能提高细菌增殖率，降低在生长过程中高营养的需求，从而加速了牛型结核分枝杆菌的生长，缩短了培养时间。该Va培养基具有阳性菌培养时间较短、生长速度较快且形成典型菌落等特点，培养成本低。牛结核杆菌培养前在Va培养基中进行预培养能够缩短培养基时间，对结核病的科研研究和早期诊断有一定的意义。

［1］潘美玉，吴龙章，陈剑锋，等. 两种不同固体培养基对结核分枝杆菌培养阳性率的影响［J］.实用医学杂志，2012，28（5）：830-831.

［2］温贵华，刘晋洪，刘婷，等. 结核分枝杆菌快速培养基临床应用研究［J］. 国际检验医学杂志，2012，33（5）：526-527.

［3］Nazym S S，Kairat A T，Bolat A Y，et al. The Medium for Acceleration of Mycobacterium tuberculosis growth［J］ . Health， 2014（6）：1866-1873.

［4］古努尔·吐尔逊，努尔巴哈提，古丽拜克热木.斯拉吾丁，等.屠宰场疑似牛结核病料的细菌分离和PCR鉴定［J］. 草食家畜，2015（3）：39-42.

［5］Lawson L，Emenyonu N，Saddiq T A，et al. Comparison of Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility using solid and liquid culture in Nigeria［J］ . BMC Research Notes，2013（6）：215-219.

［6］Chien H P，Yu M C，Wu M H，et al. Comparison of the BACTEC-MGIT-960 with Lowenstein-Jensen medium for recovery of mycobacteria from clinical specimens［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2000，4（9）：866-870.

［7］Chihota V N，Grant A D，Fielding K，et al. Liquid vs. solid culture for tuberculosis：performance and cost in a resourceconstrained setting［J］. Int J Tuberc Lung Dis 2010，14（8）：1024-1031.

［8］Srisuwanvilai L O，Monkongdee P，Podewils L，et al. Performance of the BACTEC-MGIT-960 compared with solid media for detection of Mycobacterium in Bangkok Thailand［J］. Diagn Microbiol Infect Dis，2008，61（4）：402-407.

［9］张思潮，邱志红，陆惠勤. 不同痰液标本肺结核杆菌培养结果比较［J］. 浙江预防医学，2008，20（1）：95

［10］刘志辉，罗鲁. 结核病实验室诊断现状及展望［J］. 中国防痨杂志，2003，25（3）：38-40.

［11］咸爱金. 结核分枝杆菌在两种培养基上生长情况的观察比较［J］.航空航天医学杂志. 2013，24（2）：188-189.

（责任编辑：朱迪国）

Comparison of Rapid Culture Methods of Mycobacterium Bovis

Gulnur·Tursun，Nuerbaiheti，Shayilan·Kayizha，Wang Junwei，Huxidan·Ababaikeli
（Veterinary Research Institute of Animal Science Academy of Xinjiang，Urumqi，Xinjiang 830000）

［Objective］ To apply the introduction of Va medium composition indirect method and the traditional culture medium of sodium pyruvate，L-J medium cultivation method by direct methods，to compare the bovine mycobacterium tuberculosis growth time. ［Method］The standard strains，which were processed with pre-culture in 0.1% agar Va media during 24 h and incubated in 0.3% agar Va media for 6 days at 37℃，were transferred into sodium pyruvate medium and L-J medium respectively. Meanwhile the standard strains were directly inoculated into sodium pyruvate medium and L-J medium. And then via the incubation at 37，it was observed that the examination was done daily until growth of colonies. ［Result］Growth of mycobacteria cultures of Mycobacterium bovis in sodium pyruvate medium and L-J medium was observed on the 3th day by the indirect method，and growth of the typical colonies were observed on the 12th day in the two mediums. However，growth of the colonies of mycobacteria in the sodium pyruvate medium and the L-J medium did on the 26th day and the 31th day through direct methods respectively. ［Conclusion］Introduction of the indirect method can shorten the growth time of the colonies，and provide early diagnosis basis for Mycobacterium bovis.

sodium pyruvate media；L-J media；Mycobacterium bovis；Va culture media；early diagnosis

S851.3

B

1005-944X（2015）12-0056-03

新疆维吾尔自治区国际科技合作计划项目（20136005）

呼西旦.阿巴拜克力