穴位注射骨瓜提取物注射液联合电针夹脊穴对兔骨质疏松性椎体压缩骨折二聚糖的影响*

冯艳琴　姚忠红　秦雪琴　穆敬平　陈德森

（1.湖北省十堰市太和医院，湖北十堰442000；2.湖北医药学院，湖北十堰442000）

·研究报告·

穴位注射骨瓜提取物注射液联合电针夹脊穴对兔骨质疏松性椎体压缩骨折二聚糖的影响*

冯艳琴1姚忠红1秦雪琴1穆敬平1陈德森2△

（1.湖北省十堰市太和医院，湖北十堰442000；2.湖北医药学院，湖北十堰442000）

目的观察穴位注射骨瓜提取物注射液联合电针夹脊穴对骨质疏松性椎体压缩性骨折动物模型二聚糖及血清基质金属蛋白酶（MMPs）的影响。方法雌性新西兰兔40只，随机分为模型组、穴位注射组、电针组、联合治疗组，采用去势法手术切除新西兰兔卵巢，用混有糖皮质激素的饲料饲养4个月后造成动物骨质疏松，再采用手术方法造成骨质疏松性椎体压缩骨折动物模型，造模成功后电针组电针夹脊穴30 min；穴位注射组选夹脊穴多点穴位注射骨瓜提取物注射液；联合治疗组电针夹脊穴30 min后穴位注射骨瓜提取物注射液。采用酶免疫吸附试验测定血清基质金属蛋白酶（MMPs：MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10）阳性表达率，采用免疫荧光法测定腰椎间盘组织二聚糖中的表达。结果经21 d治疗，联合治疗组腰椎间盘组织二聚糖表达明显增高，血清MMP-1、MMP-3、MMP-9明显降低，与穴位注射组及电针组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论穴位注射骨瓜提取物注射液联合电针夹脊穴治疗兔骨质疏松性椎体压缩性骨折的作用机制可能为电针夹脊穴可激发经气、活经通络、提高二聚糖黏附椎间盘细胞数量、调节椎间盘成骨细胞及破骨细胞的动态平衡，骨瓜提取物注射液穴位注射吸收后降低MMP-1、MMP-3、MMP-9对腰椎间盘基质的降解，抑制椎间盘组织退行性变，调节退变椎间盘细胞的代谢平衡，促进骨折愈合的作用。

骨瓜提取物注射液穴位注射电针夹脊穴骨质疏松性椎体压缩性骨折二聚糖基质金属蛋白酶

骨瓜提取物注射液是用新鲜或冷冻的猪四肢骨和葫芦科植物甜瓜（Cucumis melo L.）的干燥成熟种子提取物制成的［1］，富含多种游离氨基酸、甜瓜籽提取物、多肽类骨代谢因子、无机盐及微量元素等［2］，具有调节骨代谢，刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成以及调节钙、磷代谢，可增加骨钙沉积而防治骨质疏松，同时还具有镇痛抗炎作用［3］。骨质疏松性椎体压缩性骨折以腰椎L1～L5多见，由于关节软骨细胞的分解与合成代谢紊乱，其病理改变以骨质疏松、腰椎间盘突（脱）出、关节面软骨破坏、变性并继发滑液炎而造成的退行性关节疾病［4］。临床以腰椎疼痛、变形、活动受限为主要特点，目前治疗办法多以针灸抗炎消肿为主，但疗效不理想。本实验通过穴位注射骨瓜提取物注射液联合电针夹脊穴来观察其对骨质疏松性椎体压缩性骨折的影响，旨在挖掘中医药治疗关节炎优势，探讨其作用机制，为临床提供安全可靠的治疗方案。

1　材料与方法

1.1实验动物新西兰兔40只，雌性，体质量（2500± 50）g，由湖北医药学院动物中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2011-0008。

1.2试剂与仪器骨瓜提取物注射液（哈尔滨圣泰生物制药有限公司，批准文号：国药准字H23023507）；基质金属蛋白酶（MMPs）测试盒（上海森雄科技实业有限公司）；SDZ-Ⅱ型电子针疗仪（上海坤弘，型号：SDZ-Ⅱ）。

1.3分组与造模采用随机数字表编号，随机将实验动物分为模型组、穴位注射组、电针组、联合治疗组，每组10只。骨质疏松性椎体压缩性骨折动物模型的制备参照文献［5］：腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，仰卧位腹部向上固定于兔手术台，用纱布蘸取80 g/L的硫化钠剃掉兔手术区毛发，碘伏消毒，手术切除雌兔双侧卵巢，用混有糖皮质激素的饲料饲养3个月后造成动物骨质疏松。骨质疏松形成后，参照文献［6］，采用手术方法造成骨质疏松性椎体压缩骨折动物模型，手术方法：动物麻醉同上，右侧卧位固定于兔手术台，手术部位铺无菌单，碘伏消毒后于脊柱旁椎体L1～L5水平处纵行切开皮肤，皮下组织、深筋膜，暴露腹膜后间隙。钝性分离椎前肌肉及韧带，在靠近椎间盘处用钢丝剪从椎体侧前方剪断椎体前缘，剪断后不做内固定，分层缝合深筋膜、皮下组织，关闭综合皮肤，再次消毒处理。术后注意预防感染，可肌肉注射庆大霉素4万U（8万U/支，每日1次，注射7 d），本实验模型成功率为100%。

1.4治疗方法在椎体压缩骨折术后1个月待伤口愈合后，各组分别将兔固定后行相应治疗。1）电针组参照《实验针灸学》［7］，电针兔脊柱两侧夹脊穴，针刺入（深约0.5～0.8 mm），行导气手法，旁开2～3 cm配穴，以夹脊穴齐刺点为正极，配穴为负极，接SDZ-Ⅱ型电子针疗仪，连续波，频率10 Hz，留针30 min，每日1次，连续21 d。2）穴位注射组选夹脊穴多点注射骨瓜提取物注射液1 mg/（d·kg），每日1次，连续21 d。3）联合治疗组先电针夹脊穴30 min，后穴位注射骨瓜提取物注射液1 mg/（d·kg），每日1次，连续21 d。4）模型组仅固定，不做任何治疗。

1.5观察指标参照文献［8］，于治疗前后分别采用免疫荧光法测定腰椎间盘组织二聚糖中的表达；抽取耳缘静脉血，采用夹心ELISA法测定样本中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10的OD值。检测方法：1）先将耳缘静脉血样本用包被缓冲液稀释包被，加入聚苯乙烯酶标板中4℃过夜，去掉包被液，酶标板中每孔中加入200 μL封闭液，37℃恒温静置2 h后用PBS洗涤液冲洗2次并甩干；2）每孔加入不同浓度标准品稀释液振动混匀并37℃静置2 h，再用PBS洗涤3次。3）酶标板中每孔加入100 μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体，37℃静置2 h后用PBS洗涤液冲洗3次。4）酶标板中每孔加入DAB底物液100 μL，37℃避光反应10 min，每孔中加入50 μL终止液，用酶标仪测定OD值。

1.5统计学处理采用SPSS17.0软件处理，实验数据以（±s）表示，指标的比较采用单因素方差分析，组间差异采用Dunnett检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组椎间盘组织二聚糖光密度比较见表1。模型组未采取任何治疗措施，故椎间盘二聚糖光密度保持在较低水平；电针组、联合治疗组椎间盘二聚糖光密度升高，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0．05）；穴位注射组椎间盘二聚糖光密度升高不明显，与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；联合治疗组椎间盘二聚糖光密度明显升高，与穴位注射组及电针组比较，差异有统计学意义（P＜0．05）。

2.2各组治疗后兔MMPs水平比较见表2。模型组未采取任何治疗措施，故MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10阳性表达率治疗后无明显变化；穴位注射组、电针组、联合治疗组MMP-1、MMP-3、MMP-9有一定的降低趋势，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0．05），但MMP-2、MMP-10无明显变化，穴位注射组与电针组组间比较无显著差异（P＞0．05）。联合治疗组MMP-1、MMP-3、MMP-9显著降低，与穴位注射组及电针组比较，差异有统计学意义（P＜0．05），MMP-2、MMP-10有一定的降低趋势，与穴位注射组及电针组比较无显著差异（P＞0．05）。

表1　各组治疗前后椎间盘组织二聚糖光密度比较（±s）

表1　各组治疗前后椎间盘组织二聚糖光密度比较（±s）

与模型组比较，△P＜0.05；与穴位注射组比较，▲P＜0.05；与电针组比较，#P＜0.05。下同。

组别n治疗前治疗后联合治疗组100.073±0.0090.172±0.019△▲#模型组100.072±0.0080.074±0.011穴位注射组100.075±0.0100.079±0.010电针组100.077±0.0110.124±0.016△▲

表2　各组治疗21 d后兔MMPs比较（ng/L，±s）

表2　各组治疗21 d后兔MMPs比较（ng/L，±s）

组别n联合治疗组10模型组10穴位注射组10电针组10 MMP-1MMP-2MMP-3 1.89±0.15△▲#2.70±0.22 0.41±0.05▲#4.97±0.342.89±0.20 0.97±0.10 2.45±0.21△2.77±0.27 0.68±0.08△2.52±0.24△2.81±0.23 0.62±0.06△MMP-9MMP-10 1.96±0.15△▲#6.29±0.47 3.12±0.206.57±0.54 2.74±0.17△6.39±0.51 2.65±0.16△6.47±0.49

3　讨论

骨质疏松椎体压缩骨折由于机体脱钙后造成骨结构异常，多发于器官处于衰退期老年人，尤以绝经后女性为甚［9］。骨质疏松分为原发性和继发性两种类型［10］。骨质疏松患者破骨细胞数量增多，成骨细胞活动减弱，骨基质、骨钙均减少，新骨的形成远少于骨的吸收而导致骨质疏松［11］。骨质疏松后骨强度降低、骨强度的降低时，椎体骨在遭受轻微外力作用时都可能发生骨折，不仅会影响脊柱功能，还将导致呼吸、消化等多系统的功能障碍，对患者的日常生活造成严重影响［12］。骨质疏松椎体压缩骨折病因主要椎体骨质破坏与变性，是骨的分解与合成代谢失衡的结果［13］。

血清MMPs有二十多种亚型，如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10等，其中MMP-1、MMP-3、MMP-9在降解关节基质起到至关重要的作用［14］。椎体终板损伤可引起椎间盘退变，椎间盘组织细胞成分改变，蛋白多糖、水分减少导致二聚糖阳性表达下调和椎间盘退变的发生。二聚糖能黏附椎间盘细胞，并激活细胞外调节蛋白通路。二聚糖既可抑制表皮生长因子和成骨蛋白-1对椎间盘组织的合成代谢，又可抑制白细胞介素（IL）-1对椎间盘组织分解代谢的影响，从而调节正常椎间盘细胞和退变椎间盘细胞的代谢平衡，间接参与抑制椎间盘组织退变［15］。骨质疏松性椎体压缩性骨折患者椎间盘组织中二聚糖异常降低，血清MMPs阳性表达增多。

实验中选用新西兰兔以夹脊穴齐刺点为正极，配穴为负极，配合穴位注射骨瓜提取物注射液注射液。结果显示，经21 d治疗，联合治疗组腰椎间盘组织二聚糖表达明显增高，MMP-1、MMP-3、MMP-9明显降低。椎间盘退行性变的主要病理基础是骨质疏松，而骨质疏松是椎体压缩骨折诱因，构成椎间盘退行性变的主要因素有Ⅰ型胶原、硫酸角质素与硫酸软骨素的比例增多，Ⅱ型胶原、水分、蛋白多糖含量减少，增加等。这些因素均影响椎间盘生物力学。椎间盘退行性变时二聚糖等基因表达下调，二聚糖由2个糖胺多糖链黏附区和1个约45 kD的核心蛋白组成，存在于椎间盘间质细胞表面及其周围。二聚糖能黏结一些基质分子，与细胞外基质紧密联系，对退变椎间盘组织的自我修复具有重要作用。可抑制表皮生长因子椎间盘组织合成代谢及抑制白细胞介素-1对椎间盘组织分解代谢，从而调节正常椎间盘细胞和退变椎间盘细胞的代谢平衡，间接参与抑制椎间盘组织退变［16］。本实验造模后经兔自身重力作用诱导椎间盘发生退变并手术造成椎体压缩骨折，模型组时荧光强度降低，说明二聚糖阳性表达下调，椎间盘退变加剧。在电针夹脊穴治疗21 d后，荧光强度增高，提示二聚糖阳性表达上调。分析认为，电针刺激兔脊柱两侧夹脊穴时，SDZ-Ⅱ型电子针疗仪可输出低、中频电流，由于其电流的阴抗性较小，易通过人体，作用较深。同时夹脊穴可在局部形成较高的电位差，可激发经气，缓解腰椎间盘血管痉挛，促进局部小血管扩张、改善血液循环，促进骨质疏松椎体压缩骨折局部病变组织二聚糖的新陈代谢，降低痛阈、减轻腰椎间盘突（脱）出表面神经神经末梢对炎性因子IL-1β、前列腺素2（PGE2）等的刺激反应敏感度。由于骨瓜提取物注射液中富含多种游离氨基酸，为成骨细胞合成BMPs，TGF-β等骨源性生物因子提供能量和原料，促进骨源性生物因子的合成。实验证实骨瓜提取物注射液中的多肽类骨代谢因子增加BMPs的合成，抑制MMP-1过度表达［17］。联合治疗组兔在穴位注射骨瓜提取物注射液后，MMP-1、MMP-3、MMP-9显著降低，较单用电针刺激及穴位注射降低明显，这可能是穴位注射骨瓜提取物注射液吸收后抑制机体产生过多的IL-lB及PGE2等炎症因子，降低滑膜的通透性及因炎症刺激而造成MMP-1、MMP-3、MMP-9细胞阳性表达，减轻对椎间盘基质降解、促进钙、磷代谢，增加骨钙沉积［18］，防治和改善骨质疏松、延缓软骨退变及保护关节软骨、促进椎体压缩骨折愈合的作用。

［1］郭伟，李娴，贺新宁，等．骨瓜提取物注射液注射液治疗膝骨性关节炎疗效观察［J］.医学理论与实践，2014，27（7）：848-849．

［2］孙立光，欧阳慧，郝钊，等．骨瓜提取物注射液应用于四肢骨折术后患者的临床价值［J］.现代中西医结合杂志，2014，23（25）：2776-2778．

［3］钟琴，刘正奇，安阳，等．苗药痛风停汤对急性痛风性关节炎模型新西兰兔血清IL-8的影响［J］.风湿病与关节炎，2014，21（1）：16-18.

［4］谷国贞，秦同来.以灌洗为主综合治疗膝关节积液临床观察［J］.中医正骨，2004，16（7）：33-34.

［5］Gliier CC，Scholz-Ahrens KE，Helfenstein A，et a1．Ibnadronate treatment reverses glueoeorticoid-induced loss of bone mineral density and strength in minipigs［J］．Bone，2007，40（3）：645-655．

［6］张淑娴，郭新全，邱玉金，等．兔椎体骨折动物模型制备的初步探讨［J］．动物医学进展，2013，34（7）：131-134.

［7］郭义．实验针灸学［M］．北京：中国中医药出版社，2012：92-93.

［8］高瑜，邹琛，黄国付，等.电针夹脊穴对兔退变腰椎间盘组织中二聚糖表达的影响［J］．中国康复，2013，21（6）：433-436.

［9］王小忠，傅强.中医药治疗绝经后骨质疏松症研究进展［J］.河南中医，2014，34（3）：565-56.

［10］陈颖，李金艳，肖兵，等.骨质疏松症的针灸临床研究特点概述［J］.上海针灸杂志，2014，33（3）：274-277.

［11］邱明才.骨质疏松研究的现状与展望［J］.中华医学杂志，2001，81（14）：833-835.

［12］杨惠林，车亮陆俭，等．椎体后凸成形术治疗老年骨质疏松脊柱压缩骨折［J］.中华骨科杂志，2003，23（5）：263-265.

［13］黄清春，陈纪藩，陈光星，等．通痹灵、雷公藤多甙及青藤碱对实验性关节炎大鼠滑膜组织病理影响的比较研究［J］.中国医药学报，2003，18（1）：12-14．

［14］安莉萍，程鹏，刘辉，等．当归拈痛汤对佐剂性关节炎大鼠血清中MMP-3表达的影响［J］.中国中医急症，2009，18（11）：1851-1853.

［15］Ca-Szabo G，Ragass-San JD，Turumella V，et al．Changes in nRNA and protein levels of proteoglycans of the anulus fibrosus and nucleus pulposus during intervertebral disc degeneration［J］．Spine，2002，27（20）：2212-2214.

［16］Singh K，Masuda K，Thonar EJ，et al．Age-related changes in the extraeellular matrix of nucleus pulposus and anulus fibrosus of human intervertebral disc［J］．Spine，2009，34（1）：10-16．

［17］陈晓波，李丽．骨瓜提取物注射液促进骨折愈合的疗效观察［J］．中国药业，2011，20（3）：73-74．

［18］吴继彬，龚维城．基质金属蛋白酶与椎间盘退变［J］．实用骨科杂志，2006，12（6）：521-525．

Effect of Acupoint Injection of Bone Extract Combined with Electro Acupuncture on the Biglycan of the Osteoporotic Vertebral Compression Fractures

FENG Yanqin，YAO Zhonghong，QIN Xueqin，et al.Taihe Hospital of Shiyan，City，Hubei Province，Hubei，Shiyan 442000，China

Objective：To establish an animal model of osteoporotic vertebral compression fractures in New Zealand rabbits，and observe the effect of acupoint injection combined with electro acupuncture and electro acupuncture on the treatment of these diseases，and provide a theoretical basis for the clinical treatment of this disease.Methods：40 female New Zealand rabbits were randomly divided into the model group，the acupoint injection group，the electroacupuncture group，the combined treatment group，with castration method to remove the ovary of New Zealand rabbit，fed with mixed sugar cortical hormone feed for 4 months，causing osteoporosis.After making a successful model，the EA group received EA clip ridge point for 20 minutes；the acupoint injection group selected Jiaji point acupoint injection of bone melon extract injection；the combined treatment of electroacupuncture group received Jiaji acupoint injection and 30minutes later the bone melon extract injection.The positive expression rate of serum matrix metalloproteinases（MMPs metallopro-teinases，MMPs：MMPsMMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，and MMP-10）were detected with Enzyme immunoassay method，and the expression of biglycan in lumbar intervertebral disc tissue was tested with immune fluorescence method.Results：After 21 days′treatment，compared with the acupoint injection group and the electroacupuncture group，the expression of biglycan in lumbar intervertebral disc tissue of the combined treatment group increased significantly with statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：The mechanism of the treatment may be that EA Jiaji points can arouse the Qi，Tongluo，increase the number of biglycan adhesion of intervertebral disc cells，regulate the dynamic balance of the intervertebral disc cells and osteoclasts and that bone melon extract injection in acupoint injection ofabsorption decreases MMP-1，MMP-3，MMP-9 on lumbar intervertebral disc matrix degradation，inhibit intervertebral disc degenerative changes and regulate metabolic balance of degenerated intervertebral disc cells and promote fracture healing.

Bone extract injection；Point injection；Electroacupuncture at the point of the lumbar spine；Osteoporosis vertebral compression fracture model；Biglycan

R245.9+5

A

1004-745X（2015）11-1911-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.010

2015-07-01）

湖北省科技厅科技项目（2013cfc037）

（电子邮箱：cdscds1226@126.com）