轻揉推拿法对兔骨骼肌急性钝挫伤后肌球蛋白重链和胶原表达的影响

张婵娟　成羿　董学亮

轻揉推拿法对兔骨骼肌急性钝挫伤后肌球蛋白重链和胶原表达的影响

张婵娟成羿董学亮

目的 通过应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术分析内源性Ⅱb型肌球蛋白重链及Ⅲ型胶原mRNA的表达来探讨轻柔推拿法对骨骼肌钝挫伤修复的作用及其可能机制。方法 27只实验兔中24只实施后腿腓肠肌自由落体致伤，建立实验模型后分为推拿组、外伤对照组，每组12只，另取3只作为正常对照组。采用“重物自由落体致伤法”制作大白兔骨骼肌急性钝挫伤模型。分别在3d、10d、20d、27d处死大白兔，每组每个时间点处死3只兔子，每只兔子在两条后腿腓肠肌取标本，共计6个标本。结果 RT-PCR技术检测内源性Ⅱb型主要组织相容性复合体（MHC）mRNA，第3天推拿组与外伤组比较差异无统计学意义（P＞0.05），第10天推拿组与外伤组比较差异有统计学意义（P＜0.05），第20天、27天推拿组表达量比外伤组表达高（P＜0.05）。RT-PCR技术检测内源性I型胶原mRNA的表达量：第3天、10天外伤组与推拿组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。第20天推拿组表达量低于外伤组（P＜0.05）。RT-PCR技术检测内源性Ⅲ型胶原mRNA的表达量：第3天推拿组与外伤组比较差异无统计学意义（P＞0.05），第10天、20天、27天推拿组表达量低于外伤组（P＜0.05）。结论 轻揉推拿法在骨骼肌急性钝挫伤修复中晚期能有效促进Ⅱb型MHC内源性mRNA表达升高，从而促进新骨骼肌生成。轻揉推拿法在骨骼肌急性钝挫伤修复中晚期能有效降低I及Ⅲ型胶原内源性mRNA过高表达，从而减缓骨骼肌内纤维化过程的发生，改善骨骼肌愈合质量。

轻柔推拿法 骨骼肌 Ⅱb型MHC I型胶原 Ⅲ型胶原

传统的中医推拿治疗骨骼肌损伤有着独特的疗效，如何采用实验研究支持和诠释临床疗效。本实验是模仿临床中医推拿疗法，对兔子腓肠肌钝挫伤进行的治疗研究，通过应用RT-PCR技术对Ⅱb型主要组织相容性复合体（MHC）、I 型胶原、Ⅲ 型胶原mRNA的测定，来了解推拿疗法对骨骼肌损伤修复的进程和质量，探讨推拿疗法对骨骼肌修复的可能机制。

1　材料与方法

1.1动物与仪器 （1）实验动物：中国大白兔27只，平均体重（2.5±0.2）kg，雌雄各半，由浙江中医药大学动物实验中心提供。饲养及取标本皆在该中心完成。（2）主要仪器：Quantity One全自动凝胶图象分析系统（Bio-Rad公司，美国）。eppendorf centrifuge 5418高速离心机（德国）。HITACHI H-7650透射电镜（日本电子公司）。BioRad-iCycler M367999型 PCR扩增仪（Bio-Rad公司，美国）。美国Labnet Gel XL Ultra V-2电泳仪（上海）。Quantity One凝胶图象处理系统（Bio-Rad公司，美国）。Nanodrop ND-1000，ND-2000超微量核酸蛋白测定仪（北京）。Heraeus高速台式冷冻离心机（德国）。DK-8D型 电热恒温水槽（上海）。AEL-200电子天平（日本岛津公司）。（3）实验材料：兔解剖台、电动剃毛刀、自制1m高木架台、3m卷尺、1000g打击棒（直径2cm）、塑料管（直径2.2cm）。

1.2分组与造模 27只实验兔中24只实施后腿腓肠肌自由落体致伤，建立实验模型后分为推拿组和外伤对照组，每组12只，另取3只作为正常对照组。依据观察的时间点，推拿组和外伤对照组再分为4小组，每组3只。参照张静等［1］的模型，并稍加改进。造模过程：将日本大耳白兔俯卧位固定在解剖台上，在双后肢褪毛，利用重力棒选定腓肠肌肌腹中段作为落体击落目标（距跟骨6.5cm处）。将打击棒放于塑料管中，管下口垂直对准打击部位，重物自由落体下落导致一次打击伤，造成腓肠肌急性挫伤模型。打击物重1000g，下落高度50cm，重力为9.8N，动能为4.9J，打击面积约3.14cm2。

1.3实验动物的处理 造模成功后分别在第3、10、20、27天处死实验兔取标本。推拿组：伤后第3天开始推拿，10～20min/d。推拿方法：在兔小腿三头肌处采用化瘀止痛轻揉手法。先用轻推法，以大拇指指端着力于跟腱，向腘窝方向进行直线推移。频率20次/ min，持续5min。再用拇指揉法，持续5min，频率为60～80次/min。最后用擦法，即用手掌的大鱼际做跟腱与腘窝间的来回摩擦，频率80～100次/min，持续5min。外伤对照组：仅予纱布包扎伤处。

1.4观察指标 在动物损伤后第3、10、20、27天，采用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注入（40mg/kg）将实验兔麻醉后取下双侧腓肠肌损伤区域肌肉，贮于-80℃冰箱保存。采用半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）分析Ⅱb型MHC、I型及Ⅲ型胶原mRNA的表达。

1.5引物设计与合成 检索 NCB I GenBank数据库中Ⅱb型MHC、I型胶原、Ⅲ型胶原全长 mRNA序列，应用PrimerⅡ premier5.0软件设计出Ⅱb型MHC、I型胶原、Ⅲ型胶基因以及内参GAPDH基因的上下游引物序列。引物均由TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，三组的组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1推拿对修复过程中骨骼肌Ⅱb型MHC蛋白表达的影响 见表1。

表1　Ⅱb型MHC的mRNA含量同一时间点内比较（x±s）

2.2推拿对修复过程中骨骼肌Ⅰ型胶原蛋白表达的影响 见表2。

表2　Ⅰ型胶原的mRNA含量同一时间点内比较（x±s）

2.3推拿对修复过程中骨骼肌Ⅲ型胶原蛋白表达的影响 见表3。

表3　Ⅲ型胶原的mRNA含量同一时间点内比较（x±s）

3　讨论

在日常生活、施工建设、交通事故和竞技运动中，骨骼肌损伤是常见多发病。骨骼肌损伤恢复时间长，愈合质量不可靠，容易反复再伤，延续数年，直至肌肉变性和瘢痕形成。长期疼痛和肌肉弹性减弱可影响日常生活，运动员因此而丧失运动能力。推拿是我国传统医学的重要组成部分，也是中医的一大特色，其基本功效在于活血化瘀、通络舒筋、消肿止痛，从而使气行则血行，血活则瘀去，瘀去则生新，损伤的组织即可得到修复。推拿治疗骨骼肌损伤临床上具有显著疗效，故该治疗方法应用于运动员更具优势。

骨骼肌挫伤修复表现为一个动态过程，这个过程反映了组织对于创伤以及锻炼等各种超负荷状态的适应能力。所有这些情况导致了一系列病理变化的发生，包括肌纤维再生和胶原合成。创伤的反应过程是有规律的，调节和控制这一系列过程的分子机制已成为当前研究的热点。骨骼肌挫伤修复所表现的肌纤维坏死凋亡和再生及胶原合成，这两个过程相互支持同时又相互竞争制约，共同影响骨骼肌挫伤后修复的质量［2］。骨骼肌损伤会累及肌纤维、间质连接组织及血管。断裂的肌纤维向两端收缩而使肌纤维残端之间出现腔隙，该腔隙较快被血肿填充。血肿又逐渐被增殖的成纤维细胞及细胞外基质成分所取代，以保证连接组织的完整性，此过程是瘢痕形成的过程。同时，骨骼肌细胞也进行增殖而企图将两残端连接起来，此过程是骨骼肌再生的过程。以往资料多从挫伤肌肉形态结构变化、有氧代谢酶活性、血液中致痛物质变化方面探讨治疗肌肉损伤的作用机制，不能充分反映骨骼肌挫伤后愈合的过程和质量，且推拿对骨骼肌损伤治疗作用的基础研究较少。本实验采用RT-PCR技术，观察骨骼肌钝挫伤后推拿对骨骼肌挫伤修复过程中不同时间点成肌标志物及瘢痕形成标志物表达的影响，可了解骨骼肌损伤治疗后，成肌细胞增生、肌球蛋白变化和瘢痕组织形成情况，从而判断推拿在促进骨骼肌功能性恢复，减少瘢痕组织，优化骨骼肌收缩结构功能方面的作用。探讨推拿手法促进骨骼肌钝挫伤愈合的疗效和可能机制。

肌球蛋白重链是骨骼肌纤维中最重要的肌原纤维蛋白之一。其使肌纤维收缩产生能量，含有与肌肉收缩速度有关的酶活性，维持肌细胞结构的完整性。在啮齿动物中已证实了几种成年型肌球蛋白的异构体：Ⅰ型MHC存在于Ⅰ型慢肌纤维中，Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb型MHC分别存在于ⅡA、ⅡX、ⅡB型快肌纤维中。肌肉中的MHC类型对肌肉生理至关重要。而胶原作为肌细胞外成分之一，是结缔组织的主要蛋白成分，在细胞的发生、发育以及整个生命周期中起着重要作用［3，4］。依据分子组成的不同，目前发现的胶原至少有15种类型。Ⅰ型胶原主要存在于骨、肌腱、牙釉质及皮肤中；Ⅲ型胶原主要存在于皮肤、血管、子宫内膜等组织发生的早期；有些组织中Ⅰ型与Ⅲ型胶原可同时存在，如骨骼肌组织同时含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原，其中Ⅰ、Ⅲ 型胶原含量最丰富。正常骨骼肌的Ⅰ型与Ⅲ 型胶原主要位于肌内膜与肌束膜处，Ⅰ型胶原形成致密的长束状，而Ⅲ型胶原形成疏松的网状，故弹性与抗应力性均较好。完全由Ⅰ型胶原组成的组织（如肌腱组织）则几乎无弹性［5，6］。在骨骼肌组织中，胶原作为其组织连接的主要结构成分具有重要功能：其形成原纤维使骨骼肌细胞彼此相连，也使骨骼肌细胞与肌腱、筋膜组织相连接；另外，其对肌肉细胞、毛细血管及神经有支持作用，还与肌肉的机械性质及粘弹性有关。因此，Ⅱb型肌球蛋白重链及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白是骨骼肌损伤后修复研究中极有价值的指标。

本实验结果显示推拿能有效促进骨骼肌再生，与外伤对照组比较，在骨骼肌损伤的中晚期其能使MHC-Ⅱb mRNA 表达水平明显提高（P＜0.05）。同时还显示推拿治疗后，骨骼肌修复组织的Collagen-Ⅲ与Collagen-I 的 mRNA 表达水平升幅比外伤对照组低，提示该治疗方法亦能减缓纤维化过程的发生。作者认为推拿能抑制胶原的表达可能是通过促进肌细胞大量再生而抑制了瘢痕组织的形成有关，也许还存在其它机制，有待进一步的探讨。

推拿能促进骨骼肌钝挫伤后的肌肉再生和抑制瘢痕组织的形成，这似乎有利于骨骼肌组织的功能修复。作者的前期工作已经表明，推拿可以促进骨骼肌损伤后肌肉形态与结构的恢复。但是，由于组织功能的执行者是蛋白质，而从 mRNA 到蛋白质还需要一个翻译的过程。因此，作者还需了解 MHC-Ⅱb、Collagen-Ⅲ 及 Collagen-I 在骨骼肌钝挫伤修复过程中蛋白水平及其它相关指标，对推拿在骨骼肌损伤后修复过程中的作用才能作进一步的了解和客观评价。

1张静，赵斌.按摩对兔骨骼肌挫伤后修复作用的研究.河北师范大学学报，2003，15（1）：106.

2朱文辉，陈世益.肌球蛋白重链及I、Ⅲ 型胶原在骨骼肌损伤修复中的作用.中国运动医学杂志，2002，21（2）：179～182.

3Guillermo H. Graziotti， Clara M. Ríos，José-Luis L. Evidence for Three Fast Myosin Heavy Chain Isoforms in Type Ⅱ Skeletal Muscle Fibers in the Adult Llama. Journal of Histochemistry & Cytochemist ry，2001，49：1033～1044.

4Devor ST， White TP. Myosin heavy chain phenotype in regenerating skeletal muscle is affected by thyroid hormone. Med Sci Sports Exerc，1995，27（5）：674～681.

5Ellen M. Arruda， Kevin Mundy， Sarah Calve， et al. Denervation does not change the ratio of collagen I and collagen Ⅲ mRNA in the extracellular matrix of muscle. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol，2007，292： R983～R987.

6K. M. Heinemeier，J. L. Olesen，F. Haddad，et al. Effect of unloading followed by reloading on expression of collagen and related growth factors in rat tendon and muscle.J Appl Physiol，2009，106（1）： 178～186.

Objective To study the function of massage in recovery from blunt skeletal muscular contusion and its possible mechanism by using reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） technology to detect the endogenous Ⅱb MHC，I and Ⅲ collagen mRNA expression. Method 27 rabbits were randomly divided into the massage group，the trauma comparison group，each with 12 rabbits，and the normal comparison group with the other 3 rabbits. The model of the rabbits’ acute blunt skeletal muscular contusion is made by using the “blow of heavy weight free falling”. Three rabbits from each group were put to death at each time point on the 3rd day，the 10th day，the 20th day and the 27th day，with two hind gastrocnemius muscles of each rabbit taken as specimens，6 specimens in total each time. Results By using the RT-PCR technology to detect endogenous Ⅱb MHC mRNA，it showed no statistical significance to compare the massage group on the 3rd day with the trauma comparison group； it was statistically rewarding to compare the massage group with the trauma comparison group on the 10th day （P＜0.05）. Besides，the expression levels of the massage group on the 20th and 27th days were higher than those of the trauma comparison group，which was statistically rewarding （P＜0.05）. By using the RT-PCR technology to detect the expression level of endogenous I collagen mRNA，it was not rewarding statistically to compare the trauma comparison group with the massage group on the 3rd and 10th days. The expression level of the massage group on the 20th day was lower than that of the trauma comparison group （P＜0.05）. By using the RT-PCR technology to detect the expression level of endogenous Ⅲ collagen mRNA，it was not rewarding statistically to compare the massage group with the trauma comparison group on the 3rd day. The expression levels of the massage group on the 10th，20th and 27th days were lower than those of the trauma comparison group （P＜0.05）.Conclusions Firstly，the massage at the intermediate and late stages of the acute blunt skeletal muscle contusion can effectively raise the Ⅱb MHC endogenous mRNA expression. Secondly，massage at the intermediate and late stages of the recovery of acute blunt skeletal muscle contusion can effectively reduce the over-expression of I，Ⅲ collagen endogenous mRNA，thus improving the healing quality of skeletal muscles.

The effects of gentle massage Skeletal muscle Ⅱb MHC I collagen Ⅲ collagen

浙江省科技计划项目（2009C33100）

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