造纸法再造烟叶涂布液中腐败菌的分离鉴定与抑菌

田海龙，孙伟，高颖，李玲，李英，陈丽君，陈茂深，钟芳

（1.山东瑞博斯烟草有限公司，山东临沂276400；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

造纸法再造烟叶涂布液中腐败菌的分离鉴定与抑菌

田海龙1，孙伟1，高颖1，李玲1，李英1，陈丽君1，陈茂深2，钟芳2

（1.山东瑞博斯烟草有限公司，山东临沂276400；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

采用平板划线分离方法对造纸法再造烟叶涂布液中的主要微生物群进行分离，再根据细菌的菌落形态、菌体形态、生理生化实验和16S rDNA序列分析对菌株进行了鉴定。结果表明，鉴定出引起涂布液腐败的细菌为短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和肺炎克雷伯菌，其中肺炎克雷伯菌为主要腐败菌。此外，还考察了山梨酸钾、双乙酸钠、尼泊金酯钠、乙二胺四乙酸二钠和ε-聚赖氨酸等5种防腐剂对肺炎克雷伯菌的抑菌效果。结果表明，5种防腐剂的抑菌效果强弱顺序为ε-聚赖氨酸＞乙二胺四乙酸二钠＞双乙酸钠＞山梨酸钾＞尼泊金酯钠，其中ε-聚赖氨酸对肺炎克雷伯菌的最小抑菌质量浓度为0.075 mg/mL。

涂布液；细菌；分离；鉴定；抑菌

烟叶是一种经济农作物，在收获过程中会产生约5%的次级烟叶［1］。此外，在卷烟的生产加工过程中，也会产生大约占原料总量1/3的烟梗和烟末等烟草碎屑［2］。为了提高卷烟产品的品质、节约耕地、降低生产成本和原料消耗，烟草行业多年来就次级烟叶和烟草碎屑综合利用问题进行了大量而详细的研究，结果发现再造烟叶是实现废烟料综合利用的有效途径。造纸法再造烟叶具有填充值高、成丝率高、密度小、机械加工性能好和焦油含量低等优点［3］，已广泛应用于再造烟叶的生产加工过程。在造纸法再造烟叶制造过程中，烟梗和烟末分别经水浸泡提取后，将可溶物与不溶物分离，不溶物一般会与木浆纤维混合打浆，经抄纸机抄造制得片基，可溶物浓缩后制得涂布液，将涂布液均匀涂布在片基上，经烘干制得再造烟叶［4］。

研究发现，烟草中富含葡萄糖、果糖、脯氨酸和蛋白质［5］等微生物生长繁殖所需的碳源和氮源，因此微生物极易在涂布液中生长繁殖，致使涂布液腐败变质，从而影响再造烟叶的整体品质。然而，迄今为止尚未发现关于造纸法再造烟叶涂布液中腐败微生物的相关研究报道。作者对造纸法再造烟叶涂布液中的腐败微生物进行了分离鉴定，同时考察了5种广谱防腐剂对主要腐败菌的抑菌效果，确定了它们的最小抑菌浓度，从而为造纸法再造烟叶的涂布液防腐提供相关的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

涂布液：采自山东瑞博斯烟草有限公司的再造烟叶生产线；山梨酸钾和双乙酸钠：均为食品级，北京北方霞光食品添加剂有限公司；尼泊金酯钠：徐州冬荷科技有限公司；乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）：中国医药集团上海化学试剂公司；ε-聚赖氨酸（ε-PL）：浙江银象生物工程有限公司；LB培养基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母膏5 g，蒸馏水950mL，pH 7.0，121℃湿热灭菌30 min；营养琼脂培养基。

1.2仪器与设备

320-SpH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；基因组DNA快速抽提试剂盒（细菌）：生工生物工程（上海）有限公司；PYX-DHS隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；GS00001 PCR仪：GSTROM；Power pac核酸电泳仪：Bio-Rad Laboratories；Geldoc 2000凝胶成像系统：Bio-Rad Laboratories；DK-8D型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；M5酶标仪：美国Molecular Devices公司。

1.3试验方法

1.3.1取样涂布液腐败时，需要对其进行更换，在每次更换前后分别对腐败的涂布液和未腐败的涂布液取一次样：取200 mL涂布液于1 L已灭菌的蓝盖瓶中。腐败的涂布液和未腐败的涂布液各取样3次，测定其菌落总数、pH值并观察腐败前后涂布液的变化。

1.3.2菌落总数的测定菌落总数测定参考GB 4789.2-2010：涂布液以10-1的梯度进行稀释，选择其中3个合适的稀释度，吸取各梯度稀释液1 mL于平板中，采用倾注法注入营养琼脂培养基，摇匀，经37℃培养48 h后计数，每个稀释度做3次重复［6］。

1.3.3腐败菌的分离纯化将上述平板上的菌落逐一镜检，筛选出菌落形态和镜检形态不同的菌株，然后在培养基上反复进行平板划线分离，得到纯化的单个菌落［7］。

1.3.4单菌落DNA提取选用生工生物工程（上海）有限公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取单菌落DNA。

1.3.516S rDNA的PCR扩增以提取的基因组DNA为模板，正向引物为7f：5′-CAGAGTTTGATC CTGGCT-3′，反向引物为1540r：5′-AGGAGGTGAT CCAGCCGCA-3′。选用50μL体系进行聚合酶链式PCR反应。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸8min；12℃保存10min。DNA的测序由生工生物工程（上海）有限公司完成。登陆NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/），将所测得的序列与已知序列进行比对［8］。

1.3.6腐败菌的抑制将腐败菌分别在LB培养基中于37℃条件下培养24 h活化，采用平板计数法测定菌体浓度，将培养液稀释为含菌体107cfu/mL的菌悬液，4℃冰箱暂存备用［9］。

将5种防腐剂（山梨酸钾、双乙酸钠、尼泊金酯钠、EDTA-2Na、ε-PL）配制成质量浓度分别为100、10、1 mg/mL的溶液，经121℃灭菌20 min，4℃冰箱暂存备用。在含有8.9 mL的LB培养基的试管中，实验组加入1mL防腐剂溶液，0.1 mL菌悬液；阳性对照组用无菌水取代防腐剂，阴性对照组用LB培养基取代菌液。所有试管中的培养液总体积均为10 mL，使各防腐剂的终质量浓度分别为10、1、0.1 mg/mL。取各梯度稀释度及阴、阳性对照组0.2mL注入无菌的96孔培养板中，然后于酶标仪600 nm处37℃培养24 h，测定吸光值。

最低抑菌质量浓度（MIC）的测定：首先根据防腐剂3种质量浓度（10、1、0.1 mg/mL）的抑菌率，初步确定其MIC的范围，在此范围内设定密集的质量浓度梯度并测定其600 nm下的吸光值，样品孔指示菌的A600值与阴性对照组无明显差异时的质量浓度视为最小抑菌质量浓度。

2　结果与分析

2.1涂布液腐败前后比较

未腐败的涂布液和腐败的涂布液菌落总数和pH值见表1。结果表明，涂布液腐败之后，细菌大量繁殖，菌落总数增加了3个数量级。与新鲜涂布液相比，腐败涂布液的pH值有所降低，同时涂布液表面伴有少量的气泡，说明涂布液在腐败过程中，腐败菌有产酸产气现象发生。

表1　涂布液腐败前后pH值和菌落总数的变化Table 1 Changes of pH and total p late count of coating solution before and after spoilage

2.2涂布液中腐败菌的分离

根据菌落形态和镜检形态的不同，对营养琼脂培养基上腐败菌进行筛选，分离得到3株主要腐败菌：T1，T2和T3。根据群体特征、形态特征、革兰氏染色结果和生理生化特征［10］，依据《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版和第九版）对这些腐败菌进行分类鉴定。3种腐败菌的群体特征见表2。可以看出，3种腐败菌的菌落形态存在较大的差异，其中，T3的相对数量最多，而T1和T2相对数量较少。三种腐败菌的菌体形态特征见表3。结果表明，T3为革兰氏阴性菌，T1和T2为革兰氏阳性菌。

表2　腐败菌的菌落形态和相对数量Table 2 Colony characteristics and relative number of spoilage bacteria

表3　腐败菌的菌体形态特征Table 3 Mycelialmorphology of spoilage bacteria

2.3涂布液中腐败菌的鉴定

对涂布液细菌16S rDNA序列测定结果进行比对分析，结果见表4。一般来讲，在菌种分类等级上，当两个分类单位间的16S rDNA序列同源性大于97.5%时，可以认为是属于同一种细菌［11-12］。从表4可以看出，分离得到的腐败菌T1与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的同源性为99.9%，因此腐败菌T1鉴定为短小芽孢杆菌。腐败菌T2与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的同源性为99.6%，因此腐败菌T2鉴定为地衣芽孢杆菌。腐败菌T3与肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的同源性为99.6%，因此腐败菌T3鉴定为肺炎克雷伯菌。因此，分离得到的三种腐败菌分别为短小芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和肺炎克雷伯菌。

2.4涂布液中腐败菌的确定

研究表明，烟叶及烟丝样品中的水溶性糖主要是葡萄糖和果糖，此外还有少量的蔗糖和麦芽糖［13-14］。由上述讨论可知，涂布液在腐败过程中存在产酸产气现象，因此作者重点研究了3种腐败菌对上述4种糖的发酵实验，结果见表5。三种腐败菌均可以分解4种糖产酸，而仅T3（肺炎克雷伯菌）可以分解4种糖产气。综合涂布液的腐败现象，腐败菌的相对数量以及腐败菌对糖类的发酵实验，可以认为涂布液的腐败主要是由T3（肺炎克雷伯菌）造成的。

2.5涂布液中腐败菌的抑制

由上述研究可知，引起涂布液腐败的主要腐败菌肺炎克雷伯菌为革兰氏阴性菌。因此，作者参考了中华人民共和国食品添加剂使用标准（GB2760-2011），选取了对革兰氏阴性菌具有较好抑菌性的5种广谱防腐剂（山梨酸钾、双乙酸钠、尼泊金酯钠、EDTA-2Na和ε-PL），考察了它们对肺炎克雷伯菌的抑菌效果，结果见图1。由图1可知，5种防腐剂对肺炎克雷伯菌都有一定的抑菌作用，且抑菌效果随着防腐剂质量浓度的增大而加强。例如，当双乙酸钠的质量浓度为0.1 mg/mL时，其对肺炎克雷伯菌的抑菌率仅为3.9%，而当质量浓度增加到1.0 mg/m L时，其对肺炎克雷伯菌的抑菌率达到了100%。此外，从图1还可以看出，不同的防腐剂对肺炎克雷伯菌具有不同的抑菌效果，当质量浓度为1.0mg/mL时，双乙酸钠、EDTA-2Na和ε-PL的抑菌率均达到了100%，而尼泊金酯钠和山梨酸钾的的抑菌率分别只有46.8%和83.4%。总体看来，EDTA-2Na和ε-PL的抑菌效果明显优于其它防腐剂，当它们的质量浓度为0.1 mg/m L时，对肺炎克雷伯菌的抑菌率已达到100%，双乙酸钠次之，尼泊金酯钠和山梨酸钾的抑菌效果最不明显。

表4　细菌16S rDNA相似度分析Tab le 4 Sim ilarity analysis of 16S rDNA of spoilage bacteria

表5　腐败菌的生理生化特征Table 5 Physiological and biochem ical properties of spoilage bacteria

图1　不同质量浓度的防腐剂对腐败菌的抑菌效果Fig.1　Antibacterial activities of food preservatives against spoilage bacteria at differen t concentrations

表6是5种防腐剂对肺炎克雷伯菌的最小抑菌质量浓度（MIC）的测定结果，MIC越低，说明相应食品防腐剂的抑菌作用越强。从表6中可以看到，5种防腐剂的MIC值大小的排序为：ε-PL

表6　5种防腐剂对两种腐败菌的M IC值Table 6 M ICs of five food preservatives against two spoilage bacteria质量浓度/（mg/m L）

3　结语

作者从造纸法再造烟叶涂布液中分离出3种细菌，经菌体特征、菌落形态、生理生化实验和16S rDNA序列分析，鉴定出引起涂布液腐败的细菌为短小芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和肺炎克雷伯菌，其中肺炎克雷伯菌为主要腐败菌。此外，作者还考察了山梨酸钾、双乙酸钠、尼泊金酯钠、EDTA-2Na和ε-PL等5种防腐剂对肺炎克雷伯菌的抑菌效果。结果表明，5种防腐剂对肺炎克雷伯菌都有不同程度的抑菌效果，防腐剂质量浓度越高其抑菌效果越好，且不同防腐剂对腐败菌具有不同的抑菌效果。总体来看，5种防腐剂的抑菌效果强弱顺序为ε-PL>EDTA-2Na>双乙酸钠>山梨酸钾>尼泊金酯钠，其中ε-PL对肺炎克雷伯菌的MIC值为0.075mg/mL。

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科技信息

加拿大批准从枯草芽孢杆菌Gizα3508提取的木聚糖酶作为食品酶制剂

2015年10月19日，加拿大卫生部发布G/SPS/N/CAN/964号通报，公布加拿大卫生部食品司已完成了一份详细的有关申请要求将从枯草芽孢杆菌Gizα3508提取的木聚糖酶作为允许使用的食品添加剂用于面包、面粉、全麦面粉和未标准化焙烤食品中的安全评估。

从B.枯草芽孢杆菌其它特定菌株提取的木聚糖酶早已允许使用于面包、面粉、全麦面粉和未标准化焙烤食品中。

加拿大卫生部从得到的科学数据得出的评估结果支持从枯草芽孢杆菌Gizα3508提取的木聚糖酶的安全和有效应用。因此加拿大卫生部已修订食品酶允许使用列表，并于2015年10月14日生效。

该通报的目的，是公布卫生部的这项决定，为任何咨询或希望提交有关该食品添加剂安全性科学新信息的人士提供适当的联系方式，加拿大卫生部食品司将对食品添加剂的安全使用科学新信息（包括木聚糖酶）进行审核，所有想提交有关该食品添加剂使用科学新信息或咨询的人士可通过书面、普通邮件或电子邮件的方式进行。

该通报的评议截止日期为2015年12月28日，批准日期：加拿大卫生部发布食品酶允许使用列表即可合法使用，发布日期为2015年10月14日

［信息来源］厦门WTO工作站.加拿大批准从枯草芽孢杆菌Gizα3508提取的木聚糖酶作为食品酶制剂［EB/OL］.（2015-10-20）.http：//www.xmtbt-sps.gov.cn/detail.asp？id=50022

Isolation，Identification and Bacteriostasis of Spoilage Bacteria in Coating Solution of Paper-Making Reconstituted Tobacco Sheet

TIAN Hailong1，SUNWei1，GAO Ying1，LILing1，LIYing1，CHEN Lijun1，CHEN Maoshen2，ZHONG Fang2
（1.Shandong Rebirth Tobacco Co.，LTD，Linyi276400，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

In this paper，the streak plate separation method was used to classify and identify the primary bacterial flora in the coating solution of paper-making reconstituted tobacco sheetaccording to colony shape，bacterial characteristics，physio-biochem ical tests as well as 16S rDNA sequence analysis.The results indicated that the spoilage bacteria in the coating solution of paper-making reconstituted tobacco sheetwere Bacillus pumilus，Bacillus licheniformis and Klebsiella pneumonia. Among them，Klebsiella pneumoniae was the main spoilage bacteria.Moreover，the antibacterial effects of five food preservatives［potassium sorbate，sodium diacetate，butylparaben sodium，EDTA-2Naandε-polylysine（ε-PL）］on the spoilage bacteriawere evaluated.The results revealed thatantibacterialactivitiesof these five preservatives ranked as follows：ε-PL＞EDTA-2Na＞sodium diacetate＞potassium sorbate＞butylparaben sodium.Them inimal inhibitory concentration ofε-PL on Klebsiella pneumoniae was0.075mg/m L.

coating soultion，bacteria，isolation，identification，bacteriostasis

TS 41+4

A

1673—1689（2015）11—1219—06

2014-05-07

中国烟草总公司科技面上项目（中烟办〔2012〕122号）；山东中烟工业有限责任公司科技重点项目（201101003）。

田海龙（1985—），男，山东临沂人，工学学士，工程师，主要从事造纸法再造烟叶工艺技术及质量管理方面的研究。

E-mail：thl2003@126.com